陳定虎，楊雷亮，馮 云，張建威 ，潘 星，徐守振

(1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 中山 528403；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266000)

對(duì)蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是當(dāng)前嚴(yán)重危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的最主要的病毒之一。自20世紀(jì)90年代初首先在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生以來(lái)，至今已經(jīng)給世界各國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且WSSV宿主十分廣泛，常導(dǎo)致中國(guó)明對(duì)蝦（Penaeus chinensis）、日本對(duì)蝦（Penaeus japanicus）、印度對(duì)蝦（Penaeus indicus）、南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）、藍(lán)對(duì)蝦（Penaeus stylirostris）、褐對(duì)蝦（Penaeus aztecus）、桃紅對(duì)蝦（Penaeus duorarum）、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）、長(zhǎng)毛對(duì)蝦（Penaeus Penicillatus）、 墨吉對(duì)蝦（Fenneropenaeus merguiensis）等感染發(fā)病及大規(guī)模死亡，許多蟹類(lèi)對(duì)它也十分敏感。前人已經(jīng)報(bào)道了許多不同的檢測(cè)方法，如普通PCR法，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法。普通PCR法能夠檢測(cè)出微量的病毒，而實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法則又比普通PCR法檢測(cè)的靈敏度高，而且

可以防止交叉污染。由于WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)含量非常低，特別是在侵染初期濃度更低，但是即使對(duì)蝦將及為微量的病毒帶入蝦池，由于WSSV具有水平傳播的特點(diǎn)，在合適的環(huán)境條件下，該病毒也會(huì)很快繁殖且傳播開(kāi)來(lái)，給對(duì)蝦養(yǎng)殖造成毀滅性的損失，因此還必須不斷研究更為靈敏的檢測(cè)方法，才能將該病毒傳播的可能性降到最低限。筆者應(yīng)用最新的熒光PCR探針即AllGlo探針來(lái)檢測(cè)WSSV，以期提高檢測(cè)對(duì)蝦的靈敏度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 根據(jù)中山市歷年溫度的變化，在對(duì)蝦病毒最適宜繁殖發(fā)病的時(shí)節(jié)即9—10月份，從中山市對(duì)蝦養(yǎng)殖基地采表現(xiàn)白斑癥狀的南美白對(duì)蝦樣品。

1.1.2 主要儀器 3K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），DYY－11型普通電泳儀（北京六一儀器廠）；PC－818A－02型梯度PCR儀（中科公司）；ABI7500熒光PCR儀（美國(guó)ABI公司）等。

1.1.3 試劑 動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒以及Taq聚合酶 ，瓊脂糖，GREEN I核酸染料，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物等均購(gòu)自于廣州普博生物技術(shù)公司；普通PCR使用TAKARA公司生產(chǎn)的（Master Mix）；熒光PCR使用上海超世生物公司生產(chǎn)的CS Qpcr Master Mix。

1.1.4 普通PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank中 WSSV:AF332093.1，發(fā)布的基因序列，運(yùn)用DNAStar軟件首先設(shè)計(jì)出對(duì)蝦主要病毒普通PCR鑒定引物，即：WSSV-P1：5'-gat gag aca gcc caa gtt gtt aaa c-3'；WSSV-P2：5'-gca tca act tcc aca gct tta tc-3'擴(kuò)增片段預(yù)期長(zhǎng)度為599 bp，并送大連寶生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.1.5 熒光PCR引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，采用AllGlo探針專(zhuān)用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光PCR引物及其AllGlo探針并進(jìn)行MARTM熒光標(biāo)記：WSSV-FP：5'-AATCAATGAAGCATCCGAAA CA-3'；WSSV-RP：5'-TTTCATATTCT TTCCTTTTATCCCTT-3'；WSSV-P：5'-MAR-TGCTCCTGCAATAGCTGG C-MAR-3'。將探針（P）、引物（FP，RP）用水溶解成終濃度為100 μmol/L，并將引物探針稀釋至10μmol/L備用。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)蝦樣品總DNA提取 采用廣州普博生物技術(shù)公司生產(chǎn)的動(dòng)物DNA提取試劑盒提取。

1.2.2 普通PCR擴(kuò)增步驟

擴(kuò)增體系（25 μL）：在 0.2 mL 離心管中加入寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的Premix Taq預(yù)混液12.5 μL，上下游引物各1μL，對(duì)蝦樣品總DNA1μL，加滅菌蒸餾水至25 μL。

PCR 循環(huán)條件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，然后4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，以健康對(duì)蝦DNA為陰性對(duì)照。

1.2.3 瓊脂糖電泳分析

用1×TAE緩沖液和瓊脂糖按1.5%的濃度配好，在微波爐中熔化均勻，冷卻至55℃。加入GREEN I核酸染料或溴化乙錠（1 μg/mL），混合均勻，倒入凝膠平臺(tái)上，插上樣品梳。待凝膠凝固后，拔出梳子，加入適量的TAE緩沖液（緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠上表面約1 mm）。取1 μL加樣緩沖液與5 μL PCR反應(yīng)液混合均勻，然后分別將其和合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品孔中。接通電源以電壓5 V/cm進(jìn)行電泳，當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段時(shí)，停止電泳。將整個(gè)膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并照像記錄。并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，送大連寶生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)步驟

采用上海超世生物公司研發(fā)的Hot Start PCR Master MixⅠ并按照下表加樣進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 序列分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段共有599 bp大小，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中WSSV序列比較得知，與荷蘭（AF369029）、伊朗（AY870344）、新加坡（AF403003）、韓國(guó)（U89843）及臺(tái)灣（AF440570）報(bào)道的WSSV序列同源性高達(dá)99%，序列如下：GATGAGACAGCCCAAGTTGTAAACA GGCCGTTGATGAAAAATACGATGAA TTATTAGAAGATAAGGTTGAAGAAA TGAGACCGGATATAATCAATGAAGC ATCCGAAACATATGATAAACTTGCTG CTGATATGATAAGAGAGGTAGACAC TAGTGGTGTTATTGCTCCTGCAATAG CTGGCACAGTGGCAAGAACTATCAA TAATTTAAGGGATAAAAGGAAAGAA TATGAAAAGAGGCTATGGACATTAG CCTACAAACCATGGAGAAGATATGT ACAAGCAATTACAGTGATGGAATTTC GTTTATCATATAAAGACCTGACTGTC CATGCCAATTCCGATACATATTTAAC ATTCCCTTTTTTAAGAATAAAAAAGA TCGCCTATATTAATAACGACCGCGCC AGCCCCGTGAACTGCTCCTTGTCAGT GTCTTATCCCAACAAGTCCGAGTGGG GAAATGATAACGGAGTTGGACGTAA GGTTGACATACACATCAGAAGAAAT GATTTACAGGAAAAGGATCTTTACCT GTCTGTTATTTGTATGTTAGATACTG ATTTTTCAGGATATGATAAAGCT GTG GAAGTTGATGC

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)WSSV

如圖2所示，陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)典型的S曲線，說(shuō)明本檢測(cè)探針和引物設(shè)計(jì)合理。當(dāng)反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件都不變，將模板DNA以106拷貝/μL為起點(diǎn)，10倍梯度稀釋至101，通過(guò)Avogadro常數(shù)（摩爾常數(shù)）和WSSV模板DNA分子量計(jì)算其拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/mL=DNA 濃 度 g/mL×6.02×1023/DNA分子量g/mol），然后按照設(shè)計(jì)稀釋到不同的梯度，再進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，以測(cè)定本探針的靈敏度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，結(jié)果如圖4和表1，表明當(dāng)樣品DNA濃度低至100拷貝/μL時(shí)即可以有效擴(kuò)增，但在103/μL之上時(shí)結(jié)果最佳，因此在檢測(cè)對(duì)蝦體內(nèi)WSSV病毒時(shí)，樣品DNA量不可太少。用Taqman標(biāo)記的探針檢測(cè)相同量的樣品時(shí)，MAR標(biāo)記的探針（FAM 通道）CT值與FAM標(biāo)記的探針的CT值沒(méi)有明顯的區(qū)別，但是MAR標(biāo)記的探針的信號(hào)強(qiáng)度要比FAM標(biāo)記的探針約高40%（結(jié)果未顯示）。

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3 討論

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）是危害對(duì)蝦主要病毒之一，由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該病毒還不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在免疫學(xué)檢測(cè)方面還難以取得進(jìn)展，而且該病毒在對(duì)蝦體內(nèi)含量低，所以必須研究高靈敏度的檢測(cè)方法。PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物和人類(lèi)等病原物的檢測(cè)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者已經(jīng)有應(yīng)用PCR技術(shù)成功檢測(cè)WSSV的報(bào)道[1-6]。熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了可供儀器自動(dòng)檢測(cè)的熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，具有比普通PCR技術(shù)更為靈敏和快速及防污染的特點(diǎn)。而目前熒光探針幾乎均為T(mén)aqman探針，但有人在用Taqman探針做檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)無(wú)論是淬滅基團(tuán)Tamra、BHQ還是MGB，均對(duì)PCR反應(yīng)有不同程度的抑制作用，對(duì)于極低拷貝數(shù)的待檢樣品，為提高檢測(cè)靈敏度需要調(diào)高探針濃度，但濃度越高抑制作用越嚴(yán)重；為減緩抑制作用，可調(diào)低探針工作濃度，但卻無(wú)可避免地也降低了探針檢測(cè)的靈敏度，導(dǎo)致出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。既要求探針在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)有高靈敏度，同時(shí)又不能有明顯的PCR抑制作用，這個(gè)問(wèn)題一直困擾著一線的檢測(cè)技術(shù)人員。

為解決上述矛盾，本課題采用AllGloTM探針作為檢測(cè)工具。AllGlo探針是目前唯一一款在高工作濃度下既有高靈敏度，同時(shí)也不會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)有明顯抑制作用的探針，非常適合于極低濃度病原物的檢測(cè)，且特別適合于多重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)。與TaqMan探針相比較，AllGlo探針有許多新的特點(diǎn)：由于AllGlo每個(gè)探針上都能釋放出2個(gè)發(fā)光的染料基團(tuán)，沒(méi)有淬滅基團(tuán)，使得AllGlo探針亮度更高，幾乎是TaqMan探針的二倍，從而大大提高了檢測(cè)靈敏度；而且該探針使多重PCR檢測(cè)更為簡(jiǎn)單。AllGlo探針有MAR、JUP、SAT、URA、NEP 5 種顏色，分別對(duì)應(yīng)于常用的 FAM、VIC、TAMRA、ROX和Cy55個(gè)檢測(cè)通道。本研究就是用MAR基團(tuán)標(biāo)記，該基團(tuán)吸收波長(zhǎng)485～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～530 nm，對(duì)應(yīng)FAM檢測(cè)通道，對(duì)PCR反應(yīng)沒(méi)有抑制作用。與TaqMan探針和MGB探針不同，AllGlo探針即使在高濃度下也不會(huì)抑制PCR反應(yīng)。另外它比TaqMan探針特異性更強(qiáng)，短鏈的All Glo探針，其Tm=55～60℃，僅有15～16個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，使用通用程序，熱循環(huán)在95℃和60℃之間，其高特異性，足以檢測(cè)到單點(diǎn)突變。

由于AllGlo探針對(duì)于單堿基差異比較敏感，探針越短敏感度越高，即便模板發(fā)生一個(gè)堿基突變而導(dǎo)致與探針錯(cuò)配，也有可能無(wú)法檢測(cè)出信號(hào)。對(duì)于檢測(cè)變異頻率高或亞型較多的病毒而言，這款探針的確存在著一些不足。所以為更好地發(fā)揮AllGlo探針的多重檢測(cè)作用，進(jìn)行探針設(shè)計(jì)時(shí)須盡可能地選擇保守程度高的DNA序列區(qū)域。若無(wú)法找到理想保守區(qū)域時(shí)，一方面可考慮AllGlo結(jié)合兼并堿基的設(shè)計(jì)策略；另一方面也可考慮采用單重檢測(cè)，此時(shí)建議結(jié)合使用Taqman探針，因?yàn)檫@類(lèi)探針即便與模板有一到幾個(gè)堿基錯(cuò)配依然有可能檢測(cè)出信號(hào)，這對(duì)于防止漏檢有一定的積極作用。

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