向宏社,何俊清

1.巴東縣清太平鎮(zhèn)衛(wèi)生院(湖北 巴東 444321)

中成藥凈膚液為恩施州中心醫(yī)院自制制劑，全方合用，具有消炎、抗病毒、殺滅疣體以及抗復發(fā)等作用。作者通過長期臨床觀察，將凈膚液作為治療尖銳濕疣的輔助治療藥物，起到了很好的臨床治療作用[1]。為了進一步探討其抗病毒作用的機制，本實驗對凈膚液進行了抗病毒感染的體外實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 凈膚液 凈膚液由湖北省恩施州中心醫(yī)院中醫(yī)副主任醫(yī)師何俊清主持的恩施州科技項目，采用苦參、黃柏、川椒、地膚子、土茯苓、大黃、百部、千里光、甘草等為主選藥組方，加水煎煮濃縮而成的中藥外用熏洗制劑(1.0 g/ml)。

1.1.2 病毒 HPV病毒由恩施州中心醫(yī)院皮膚科采集于尖銳濕疣(CA)患者外陰部位的疣體標本。

1.1.3 試劑與儀器 2.5%氟尿嘧啶乳膏(珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司，批號：20050412) ；ABI PRISMTM7700熒光定量PCR儀(美國PE公司)；TGL-16C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱(南京實驗儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗尖銳濕疣病毒實驗

1.2.1.1 CA混懸液的制備 將CA患者外陰部位的疣體標本(經鑒定為HPV6/Ⅱ型)，勻漿后加入生理鹽水，配成一定濃度的離體CA混懸液。

1.2.1.2 樣品作用疣體的方法 實驗分四組，即空白基質組、生理鹽水組、凈膚液組和氟尿嘧啶軟膏治療組，每組設4個重復?？瞻谆|組取CA混懸液和蒸餾水各25 μl至1.5 ml離心管中，生理鹽水組取CA混懸液和生理鹽水各25 μl至1.5 ml離心管中，凈膚液組取凈膚液和CA混懸液各25 μl至1.5 ml離心管中，氟尿嘧啶軟膏治療組取2.5%氟尿嘧啶軟膏和CA混懸液各25 μl至1.5 ml離心管中。分別在樣品作用疣體2、4、6 d后取樣，進行HPV-DNA的提取。

1.2.1.3 HPV-DNA的提取 從溫浴箱中取出經樣品作用的CA混懸液，加入DNA提取液，提取得HPV-DNA作擴增模板。

1.2.1.4 DNA擴增 加入試劑盒中一定量的PCR反應液、Taq DNA聚合酶、UNG和HPV-DNA模板于擴增反應管中，置入定量PCR儀中。設置程序為：37℃，5 min；94℃，1 min；95℃，5 s；60℃，30 s，循環(huán)40次。HPV-DNA經高溫變性、低溫退火及延伸進行循環(huán)擴增。

1.2.1.5 定量方法及建立標準曲線 按文獻[2]HPV-DNA擴增后經熒光探針檢測擴增數量，另取試劑盒中5個濃度的HPV-DNA定量陽性標準品(5×108/ml，5×107/ml，5×106/ml，5×105/ml，5×104/ml)，同上法擴增及熒光檢測，以起始拷貝數的自然對數為橫坐標、循環(huán)閾值為縱坐標，得到的回歸直線為標準曲線(r=0.9990)，據此對樣品的擴增數量進行定量。

1.4結果抗CA病毒實驗的結果見表1。經凈膚液作用2 d后，病毒數明顯減少；作用4 d后PCR結果即為陰性，說明對病毒有明顯破環(huán)作用，抑制其復制擴增；2.5%氟尿嘧啶軟膏作用2 d后，其病毒數亦明顯減少，到作用4 d后PCR結果即為陰性；而空白基質、生理鹽水的陽性結果表明其對病毒沒有影響。

表1 凈膚液不同時間對HPV-DNA的作用(n=5)

2 討論

人乳頭瘤病毒是一種致尖銳濕疣的DNA病毒，近年來，尖銳濕疣發(fā)病率逐年上升，已位于性傳播疾病第二位，它是由人乳頭瘤病毒引起的良性增生，病變侵犯區(qū)域僅限于表皮粘膜，不突破基底層，病理表現類似于鱗癌。人類又是它的唯一宿主[3，4]，故難以采用動物模型法進行治療藥物的藥效學試驗。筆者采用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)技術進行其體外抗病毒藥效學試驗，通過定量檢測經藥物作用后的HPV-DNA的擴增數量，從而考察凈膚液對離體CA皮損組織的抗病毒作用，結果顯示凈膚液對人乳頭瘤病毒具有明顯的破壞作用，其作用機制是通過抑制人乳頭病毒DNA復制，而對尖銳濕疣產生明顯的治療效果。有文獻報道[5，6]食療及中藥干預可迅速恢復臟腑功能的協調，糾正人體免疫缺陷，干擾病毒復制，增強細胞免疫因子殺死病毒，從而達到全面排毒、標本兼治的目的。凈膚液為中成藥復合制劑，在此方中，苦參清熱燥濕、祛風殺蟲，常用于治療疥癬、陰癢之癥；黃柏清熱燥濕瀉火，常用于治療帶下濕癢、火毒癰瘡等；川椒專攻殺蟲；地膚子祛濕止癢，常用于治療疥癬、皮膚瘙癢、帶下等；土茯苓清熱解毒力強，為治梅毒癥之要藥；大黃清熱、破瘀消腫、殺蟲止癢；百部殺蟲止癢，常于于治療陰癢、疥癬、蟲證等；千里光清熱、去腐生肌，常用于治療皮膚瘙癢癥；甘草調和諸藥，有清熱解毒功效。

綜上所述，凈膚液對人乳頭瘤病毒具有明顯的破壞作用，為凈膚液抗病毒作用及殺滅疣體提供了理論依據，也為凈膚液的臨床推廣應用提供了更加確實的實驗數據。

[參考文獻]

[1] 何俊清，雷淑英，張世福.凈膚液熏洗配合冷凍治療尖銳濕疣80例[J].湖北中醫(yī)雜志，2002，24(10)：45.

[2] 孫靜，陳曲波，張林林，等.乙肝標志物模式與HBV-DNA定量的比較分析[J].現代中西醫(yī)結合雜志，2002，11(8)：750-753.

[3] 張華，李秉煦.人類乳頭瘤病毒感染的局部用藥[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26(2)：202-203.

[4] M1akar B．Anoscopy could be beneficial for women with external anogenital condy1oma[J].Eur J Obstet Gyneco1 Reprod Biol,2007,133(1)：121-122.

[5] 陳筱波，黃舜蓓.食療及中藥綜合干預對高危型人乳頭瘤病毒陰轉療效分析[J].現代實用醫(yī)學，2010，22(7)：801-802.

[6] 趙銀玲，葉麗華，徐桂香.中西醫(yī)結合治療宮頸糜爛合并持續(xù)高危型人乳頭瘤病毒感染的臨床分析[J].中國現代醫(yī)生，2010，48(20)：57-61.