周防震，張曉元，郭 勇

1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院(廣東 廣州 510006)

乳腺癌發(fā)病率高，居女性惡性腫瘤的首位[1]。阿霉素(Adriamycin, ADM)是在臨床上廣泛應(yīng)用的一種化療藥物,具有抗瘤譜廣、 抗瘤作用強(qiáng)等特點(diǎn), 特別是對(duì)乳腺癌有顯著療效[2],但在臨床腫瘤化療中有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，尤其是心臟毒性限制了阿霉素的臨床應(yīng)用。因此努力尋找有效的藥物和最優(yōu)化的治療是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)，化學(xué)名為3,5,7,3，4，5，-六羥基-2,3雙氫黃酮醇，是從藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物莖葉中提取的一種二氫黃酮醇化合物。研究表明DMY具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、止咳、廣譜抑菌、保肝護(hù)肝、降血糖、降血脂、增強(qiáng)人體免疫力等多種生理活性[3]。近年來(lái)其抗腫瘤作用日益引起人們的重視。已有資料顯示，DMY對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞、鼻咽癌HK-1細(xì)胞、肝癌Bel-7402細(xì)胞、白血病HL-60、K562細(xì)胞和肺癌H1299細(xì)胞[4～6]，都有較強(qiáng)的體外抑制作用。但DMY聯(lián)合化療藥物共同作用于癌細(xì)胞的體外作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討DMY是否可以通過(guò)與治療乳腺癌的常用藥物ADM聯(lián)合,提高ADM的抑癌作用，減少用藥量及減低其不良反應(yīng),以期為臨床提高乳腺癌的治療效果提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由暨南大學(xué)生物工程研究所孫奮勇教授惠贈(zèng)。注射用鹽酸阿霉素購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。DMY(99%，HPLC)購(gòu)自上海同田生物公司。DMEM、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜 (DMSO)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、 5%CO2溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用 MTT法[7]分別檢測(cè)DMY和ADM兩藥的單用和聯(lián)用的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞稀釋成2.8×104/ml的單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔180 μl,空白組僅加入不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12 h后在藥物組中加入20 μl含不同濃度的DMY和ADM的完全培養(yǎng)基，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/ml和0.625、1.25、2.5 、5、10 μg/ml。每個(gè)濃度 5個(gè)平行孔,兩藥聯(lián)用比例為1∶1方案。實(shí)驗(yàn)組亦給予不同濃度的含藥培養(yǎng)基,細(xì)胞對(duì)照組和空白組均給予完全培養(yǎng)基。當(dāng)藥物作用48 h后,除去上清培養(yǎng)液,每孔中加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去含MTT的培養(yǎng)液，往每孔加入200 μl DMSO，輕輕振蕩，使細(xì)胞中形成的甲瓚結(jié)晶充分溶解，然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm的光吸收值(A)，按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/細(xì)胞對(duì)照組A值)×100%。以藥物濃度為橫軸，抑制率為縱軸，繪出增殖抑制曲線。以藥物濃度的對(duì)數(shù)與抑制率進(jìn)行直線回歸并求出IC50。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用Microcal Origin 6.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 DMY和ADM對(duì)MDA-MB-231的抗增殖作用比較DMY的DMSO溶液(16.7 μg/ml)的紫外掃描光譜圖見(jiàn)圖1A，在291 nm處有最大吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。實(shí)驗(yàn)中DMSO濃度<0.05%，該濃度對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響(數(shù)據(jù)未列出)。DMY或ADM單用48 h，隨著藥物濃度增加其效應(yīng)均增加(圖1B、圖1C和表1)。DMY和ADM作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h的IC50值分別為54.8 μg/ml和1.3 μg/ml。

2.2兩藥單用和聯(lián)用的效應(yīng)按照中效方程式直線回歸計(jì)算出斜率(m)、相關(guān)系數(shù)(r)及中效濃度(Dm)，見(jiàn)表2。再計(jì)算出兩藥合用時(shí)出現(xiàn)不同效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)CI，從而判斷兩藥在不同效應(yīng)時(shí)各自所需藥物濃度之間相互作用，見(jiàn)表3。然后以效應(yīng)(fa)為橫坐標(biāo)，合用指數(shù)(CI)為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖2。隨著用藥劑量的增大，兩種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231增殖抑制效應(yīng)也增強(qiáng)；兩藥合用作用于指數(shù)增殖期的MDA-MB-231細(xì)胞，當(dāng)fa=0.75，即使75%左右的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制時(shí)，CI≈1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)相加；當(dāng)fa<0.75, CI<1，兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)fa>0.75時(shí)，兩藥合用效應(yīng)拮抗。兩藥在低濃度合用時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞可以產(chǎn)生較好的協(xié)同作用。抑制效應(yīng)為0.70時(shí)，DMY與ADM同時(shí)應(yīng)用，相對(duì)于它們單獨(dú)應(yīng)用并取得相同效應(yīng)時(shí)的劑量DMY減少了77.6%，而ADM減少了50.3%。

圖1 DMY的紫外吸收光譜及DMY或ADM單用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用

表1 兩種藥物單用及合用在不同濃度(μg/ml)時(shí)的效應(yīng)(fa)(n=6)

表2 DMY和ADM單用及合用時(shí)的斜率(m)、中效濃度(Dm)和相關(guān)系數(shù)(r)

表3 兩種藥物合用時(shí)在不同效應(yīng)(fa)時(shí)的合用指數(shù)(CI)

圖2 DMY與ADM合用時(shí)的效應(yīng)與合用指數(shù)曲線

3 討論

二氫楊梅素又名蛇葡萄素，廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中[9,10]，其中又以顯齒蛇葡萄幼嫩莖葉(民間稱(chēng)“藤茶”)中含量最高，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南，是一種古老的藥食兩用植物，長(zhǎng)期作為類(lèi)茶植物和中草藥在民間廣泛使用。在藤茶的春夏幼嫩莖葉中，黃酮類(lèi)化合物占資源干重的35%～45%，其中二氫楊梅素又占資源干重的20%～30%，其主要活性成分二氫楊梅素(DMY)是目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的二氫黃酮類(lèi)化合物中單體含量最高的植物[3]。藤茶中二氫楊梅素不僅含量豐富，且毒性極低[11]，具有開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物和化療藥物增敏劑的巨大潛力。已有研究表明二氫楊梅素能在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能為①誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[12,13]；②抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14,15]；③抑制腫瘤血管生成[16]；④抑制端粒酶活性[17]等。本研究以人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231為研究對(duì)象，結(jié)果表明二氫楊梅素具有抗MDA-MB-231細(xì)胞增殖的作用，作用48 h的IC50值為54.8 μg/ml，其抗癌作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

阿霉素作為一種周期非特異性廣譜抗癌藥物,對(duì)多種腫瘤均有明顯療效，已廣泛應(yīng)用到乳腺癌的臨床化療中。但其對(duì)多個(gè)器官具有毒副作用(胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、心臟毒性等)，特別是心臟毒性[18]；那么，在治療效應(yīng)得到保證的前提下如何降低其使用濃度和毒副作用，是腫瘤防治的棘手問(wèn)題。本研究結(jié)果表明，當(dāng)fa≤0.75時(shí)兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，即兩藥在低濃度合用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞可以產(chǎn)生較好的協(xié)同作用。抑制效應(yīng)為0.70時(shí)，DMY與ADM同時(shí)應(yīng)用，相對(duì)于它們單獨(dú)應(yīng)用并取得相同效應(yīng)時(shí)的劑量DMY減少了77.6%，而ADM減少了50.3%。ADM用藥劑量的減少導(dǎo)致藥物毒性的減弱并因此改善整體的治療效果，暗示DMY可能對(duì)化療藥物ADM具有增敏作用。但是，DMY是參與了細(xì)胞對(duì)ADM的攝取、降解、代謝發(fā)揮作用，還是本身或其降解代謝過(guò)程中的成分與ADM相互作用而發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步證實(shí)。可以肯定的是，DMY本身對(duì)MDA-MB-231有較好的抑制增殖效應(yīng)，且可作為一種安全、有效、廉價(jià)的中藥，聯(lián)合ADM使用能夠降低ADM的劑量，因此，可以推測(cè)其作為臨床輔助ADM殺滅乳腺癌細(xì)胞，降低ADM的毒副作用會(huì)有較好的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 甄林林,武正炎,范萍,等.人乳腺癌裸鼠移植模型的建立[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(6):509-510.

[2] Bonadonna G.Evolving concepts in the systemic adjuvant treatment of breast cancer[ J].Cancer Res,1992,52(8):2 127-2 137.

[3] 張友勝,寧正祥,楊偉麗. 藤茶學(xué)[M]. 廣州：廣東科技出版社,2003.

[4] 周寧寧,孝峰,謝冰芬,等.無(wú)刺根中蛇葡萄素體外抗腫瘤作用研究[J].廣東藥學(xué),2000,10(4):7-8.

[5] 朱孝峰,謝冰芬,劉宗潮,等.蛇葡萄素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及周期影響[J].中草藥,1999，30(增刊):165-166.

[6] Seong H，Chun W，Choi,Y J,et al.Cytotoxic constituents from the bark of Salix hulteni[J].Archives of Pharmacal Research，2008,31(8):978-982.

[7] Sargent JM,Taylor CG.Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia[J].Br J Cancer,1989,60(2):206-210.

[8] Ting C C,Robert J，Motzer Y T,et al.Bosl.Computerized Quantitation of Synergism and Antagonism of Taxol,Topotecan,and Cisplatin Against Human Teratocarcinoma Cell Growth:a Rational Approach to Clinical Protocol Design[J].J National Cancer Institute,1994,86:1 517-1 524.

[9] 張友勝,楊偉麗,熊皓平.RP-HPLC法測(cè)定顯齒蛇葡萄植物中楊梅素的含量[J].中草藥,2001,32(11):983-985.

[10] Yabe N,Tanaka K,Matsui H.An ethanol-extract of Ampelopsis brevipedunculata (vitacease) berries decreases ferrous iron-stimulated bepatocyte injury in Culture[J].J Ethnopharmcology,1998,59(3):147-159.

[11] 張友勝，寧正祥，胡閆勇.黃酮類(lèi)化合物二氫楊梅素的研究利用現(xiàn)狀[J].中成藥，2002，24:970.

[12] 劉德育,羅曼,謝冰芬,等.蛇葡萄素的抗腫瘤作用研究[J].癌癥，2001,20(12):1 372-1 375.

[13] 尹梅梅，潘振偉,蔡本志,等.二氫楊梅素誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GZY-83-a凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2008,24(5):626-630.

[14] 鄭宏強(qiáng),劉德育.蛇葡萄素抗黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[J].癌癥,2003,22(4):363-367.

[15] 劉德育，鄭宏強(qiáng),羅高琴.蛇葡萄素體內(nèi)外對(duì)小鼠B16黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用[J].中國(guó)中藥雜志,2003,28(10):957-961.

[16] 羅高琴,曾颯,劉德育.蛇葡萄素的血管生成抑制作用[J].中藥材,2006,29(2):146-150.

[17] 蔣才武,李炳超,唐乾利.雙氫楊梅素與G-四鏈體的相互作用研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2007,65(19):2 159-2 162.

[18] 蔣宇翔,陳棟,王瑋,等.p38MAPK抑制劑增強(qiáng)阿霉素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的體外研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(1):130-133.