周 婷 王世宣 翁丹卉 盧運(yùn)萍 馬 丁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030

RNA干擾(RNAi)是運(yùn)用雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默機(jī)制[1],能特異性抑制靶基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平及功能。新近的RNAi技術(shù)是利用DNA載體直接在體內(nèi)表達(dá)發(fā)卡狀的siRNA(shRNA),特異性封閉相應(yīng)的靶mRNA,抑制mRNA的翻譯。與早期的RNA干擾技術(shù)相比,該方法的特異性和干擾效率均有較大提高,已廣泛應(yīng)用于各種研究領(lǐng)域。紫杉醇類化療藥物泰素作為全球第一種被確證的微管穩(wěn)定藥物,在實(shí)體瘤的治療方面取得了巨大成功,但臨床上耐藥病例仍頻繁發(fā)生[2]。紫杉醇通過抑制微管解聚進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期殺傷腫瘤,有研究提示這種殺傷作用有賴于具有完整功能的紡錘體檢查點(diǎn)。紡錘體檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期的最后關(guān)卡[3]。紡錘體檢查點(diǎn)功能低下時(shí)有發(fā)生,而這種功能低下與某些紡錘體蛋白的低表達(dá)有關(guān)。Bub1作為紡錘體檢查點(diǎn)的平臺(tái)蛋白,在維持紡錘體檢查點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮了重要作用。目前紡錘體檢查點(diǎn)功能是國(guó)際分子生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn),但國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究甚少,本研究旨在運(yùn)用RNAi技術(shù),特異、穩(wěn)定地抑制卵巢癌細(xì)胞Bub1 mRNA及蛋白水平表達(dá),以對(duì)其在卵巢癌細(xì)胞紫杉醇化療過程中的功能進(jìn)行初步研究,并為進(jìn)一步的機(jī)制探討打下良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pEGFP-C1空質(zhì)粒為本室保存;轉(zhuǎn)染試劑Lipo 2000TM購(gòu)自Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克,凝膠回收試劑盒購(gòu)自Gibco公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司;T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司;四甲基偶氮唑鹽(MT T)、二甲亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)及紫杉醇購(gòu)自德國(guó)Sigma公司,PCR引物由上海生工公司合成?？谷薆ub1單克隆鼠抗購(gòu)自Chemicon公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 人pEGFP-Bub1-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

根據(jù)GenBank提供的Bub1基因序列,使用美國(guó)Ambio公司在線設(shè)計(jì)軟件,通過基因序列比對(duì),挑選出3條特異性寡核苷酸序列:序列1(GAGTGATCACGATT TCTAA)、序 列 2(CCAUGGGAUUGGAACCCUGTT)及序列 3(CCAGGCUGAACCCAGAGAGT T),合成相應(yīng)的shRNA正義鏈及其互補(bǔ)鏈。以 RNAi-Ready pSI-RENDNR-DsRed-Express Vector質(zhì)粒為模板,采用PCR方法擴(kuò)增出帶有U6啟動(dòng)子和shRNA序列的表達(dá)框,測(cè)序后分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切,插入同樣以EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切的pEGFP-C1質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化酶切產(chǎn)物,后者與合成序列以T4連接酶連接3 h,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α。篩選可疑重組陽(yáng)性菌株,250 r/min搖菌過夜,小提質(zhì)粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,鑒定正確者送Invitrogen公司測(cè)序,測(cè)序正確者保種,將獲得的人 Bub1重組質(zhì)粒命名為 pEGFPBub1-shRNA,大量提取質(zhì)粒進(jìn)行下一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定篩選

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系購(gòu)自ATCC,細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的McCoy's 5a培養(yǎng),37℃,5%CO2,常規(guī)消化傳代。3×105個(gè)/孔接種 6孔板,待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,每孔加入8 μ L脂質(zhì)體和 4.0 μ g質(zhì)粒,同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組。48 h后加入濃度為500 mg/L的G418進(jìn)行篩選,待對(duì)照細(xì)胞死亡殆盡時(shí)改用維持濃度200 mg/L,2周后挑取穩(wěn)定的克隆進(jìn)行鑒定,具有明顯沉默效應(yīng)者轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Bub1基因mRNA水平的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞,Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA,以M-MLA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增,同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照,以檢查Bub1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。Bub1引物序列:上 游 引物 5′-TAAACCCACAGGAGCCAGGAC-3′;下游引物 5′-CAAGCCTCAACGCCCAACT-3′;擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s,56.5℃45 s,72℃30 s,29個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。GAPDH 引物 :上游引物:5′-ACGGATT TGGTCGTATTGGG-3′;下 游 引物 :5′-TGAT TT TGGAGGGATCTCGC-3′;擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性 5 min;95℃30 s,54℃45 s,72℃30 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察并拍照,每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bub1蛋白水平的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,提取總蛋白,40 μ g蛋白行SDS-PAGE電泳,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,用含0.05%Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次,每次10 min;加入相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000),37℃孵育1 h,用顯色底物NBT/BCIP/buffer(1∶1∶250)顯色,以等量β-actin蛋白質(zhì)作為對(duì)照,每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.6 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

將經(jīng)過穩(wěn)定篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)后的各組細(xì)胞,胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為8×103/孔接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后以含不同濃度(30、90、300、1 000 nmol/L)紫杉醇的MaCoy'5a培養(yǎng)液200 μ L進(jìn)行處理,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)不加藥物和不加細(xì)胞的空白以及陰性對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加1 mg/mL MT T 溶液100 μ L 作用4 h,棄上清液,每孔加入 DMSO 150 μ L,振蕩使其充分溶解,在96孔板酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm的吸光度值(A),按如下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)孔A/不加藥物孔A)×

100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率

收集經(jīng)紫杉醇(1 μ mol/L)作用24及 48 h的轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞,以冷PBS洗滌之,70%乙醇于-20℃固定過夜,洗滌,離心1 500 r/min,5 min,后加入含有 10 μ g/mL PI和0.1%RNase A 的 PBS液500 μ L,室溫避光染色30 min后上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.8 圖像分析

RT-PCR和Western blot結(jié)果經(jīng)Uvp grabit Image1軟件采集,Gelworks 1D Advanced V4.01軟件處理分析,計(jì)算條帶的積分吸光度(IA),采用目的條帶與GAPDH的IA比值表示待測(cè)樣本的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,差異顯著性檢驗(yàn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)和方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒酶切、鑒定及測(cè)序

將合成的3段退火片段分別與線性載體連接、轉(zhuǎn)化后,分別挑取3～4個(gè)克隆,經(jīng)擴(kuò)增,提取質(zhì)粒DNA,雙酶切鑒定及測(cè)序,確定其中的6個(gè)克隆(2、4、5、7、11及12號(hào)克隆)插入一段大約360 bp的片段(含1個(gè)U6啟動(dòng)子),測(cè)序證實(shí)插入片段完全正確(圖1)。

圖1 人真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Bub1-shRNA的酶切鑒定Fig.1 Identification of the human recombinant plasmid pEGFP-Bub1-shRNA

2.2 穩(wěn)定篩選

將得到2號(hào)(序列3)、7號(hào)(序列 2)及12號(hào)(序列1)克隆進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取,無菌化處理質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,G418加壓篩選2周后可見有細(xì)胞克隆形成,倒置熒光顯微鏡下觀察克隆中95%以上的細(xì)胞可見較強(qiáng)的綠色熒光(圖2),挑取克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 pEGFP-C1和pEGFP-Bub1-shRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞G418篩選后穩(wěn)定表達(dá)(×40)Fig.2 The green fluorescence in SKOV3 cells observed under the fluorescent microscope after transfected with plasmids(×40)

2.3 各組細(xì)胞中Bub1 mRNA的表達(dá)

凝膠電泳分析各組細(xì)胞Bub1 mRNA表達(dá)的差異,由圖3可見,pEGFP-C1/SKOV3組和SKOV3組細(xì)胞約450 bp處條帶清晰明亮,7號(hào)及12號(hào)克隆所對(duì)應(yīng)的pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3在同樣位置出現(xiàn)模糊條帶,而2號(hào)克隆與對(duì)照組相比無明顯差異。經(jīng)相對(duì)強(qiáng)度對(duì)比分析,7號(hào)及12號(hào)克隆相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為(0.25±0.05)和(0.18±0.03),pEGFP-C1/SKOV3組為(0.70±0.08),7號(hào)及12號(hào)克隆與pEGFP-C1/SKOV3組相比差異均有顯著性意義(P＜0.05),12號(hào)克隆的干擾效應(yīng)強(qiáng)于7號(hào)克隆。以上結(jié)果說明,序列1對(duì)應(yīng)的pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒的干擾效應(yīng)在三者中最強(qiáng),后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行。

圖3 各組細(xì)胞中Bub1 mRNA的表達(dá)Fig.3 Bub1 mRNA expression in cells of each group

2.4 各組細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的表達(dá)

由圖4可見,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3細(xì)胞Bub1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(Bub1/β-actin)為(0.10±0.04),而 pEGFP-C1/SKOV3和 SKOV3細(xì)胞Bub1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為(0.80±0.03)和(0.78±0.04),以上結(jié)果說明,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3細(xì)胞Bub1蛋白表達(dá)水平較 pEGFPC1/SKOV3和SKOV3兩組細(xì)胞明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 各組中Bub1蛋白的表達(dá)Fig.4 Bub1 protein expression in cells of each group

2.5 各組SK OV3細(xì)胞紫杉醇敏感性

如圖5所示,紫杉醇濃度為 90、300及1 000 nmol/L時(shí),pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著低于pEGFP-C1/SKOV3和SKOV3細(xì)胞,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);由表1可以看到,以1 μ mol/L紫杉醇作用 24及 48 h,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3組細(xì)胞的凋亡率顯著低于pEGFP-C1/SKOV3組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);pEGFP-C1/SKOV3和 SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Fig.5 The inhibition rate of proliferation in each group

表1 1μ mol/L紫杉醇處理后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡率(±s,%)Table 1 The apoptosis rate of cells treated with paclitaxel at different time points in each g roup(±s,%)

表1 1μ mol/L紫杉醇處理后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡率(±s,%)Table 1 The apoptosis rate of cells treated with paclitaxel at different time points in each g roup(±s,%)

*P＜0.01 vs pEGFP-C1/SKOV3 group

Groups 0 h 24 h 48 h SKOV3 1.63±0.35 10.14±1.73 34.17±3.22 pEGFP-C1/SKOV3 2.43±0.42 12.15±1.97 37.22±3.88 pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3 2.20±0.27 4.42±0.62*12.98±1.94*

3 討論

RNAi現(xiàn)象自1998年被發(fā)現(xiàn)以來,已逐步成為腫瘤相關(guān)基因領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。從小分子干擾RNA技術(shù)到shRNA技術(shù),RNAi技術(shù)在穩(wěn)定性和臨床應(yīng)用潛能上得到了深入發(fā)展[4]。siRNA干擾效果不穩(wěn)定,在哺乳動(dòng)物中時(shí)效性差,且siRNA在細(xì)胞內(nèi)容易被降解,對(duì) RNase-free環(huán)境要求高,與siRNA技術(shù)相比,shRNA技術(shù)既保持了siRNA特異性高的優(yōu)勢(shì),且其具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性,能夠持續(xù)發(fā)揮抑制作用以便研究者在更長(zhǎng)的時(shí)間跨度中對(duì)基因功能進(jìn)行深入探索。本研究構(gòu)建的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Bub1-shRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞SKOV3后,該細(xì)胞內(nèi)Bub1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),證實(shí)構(gòu)建的pEGFP-Bub1-shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能高效阻斷Bub1基因表達(dá),為進(jìn)一步研究Bub1基因的生物學(xué)功能提供了有力工具。

細(xì)胞在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生的監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點(diǎn)與微管聯(lián)接及其產(chǎn)生的張力、染色體排列、確保姐妹染色單體精確分離的質(zhì)控機(jī)制,即紡錘體檢查點(diǎn),又稱有絲分裂檢查點(diǎn)[5]。蛋白激酶Bub1作為紡錘體檢查點(diǎn)的平臺(tái)蛋白,可能是紡錘體檢查點(diǎn)其他組分定位于紡錘體檢查點(diǎn)的基礎(chǔ)。Bub1可通過直接作用及形成復(fù)合物的形式來調(diào)控其他重要的紡錘體檢查點(diǎn)蛋白,如Bub3、Mad2及CDC20等,進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程[6]。雖然臨床大樣本的研究提示紡錘體檢查點(diǎn)基因突變頻率極低,但多種腫瘤細(xì)胞確實(shí)存在紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷,而有研究表明這種缺陷可能與紡錘體檢查點(diǎn)蛋白表達(dá)異常有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中存在Bub1 mRNA低表達(dá)[7];Shichiri及其研究小組[8]發(fā)現(xiàn)大腸癌組織Bub1整體表達(dá)水平明顯高于鄰近正常組織,與此同時(shí),少數(shù)Bub1 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常組織的大腸癌似乎更易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā);此外,有研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織Bub1 mRNA顯著高表達(dá),且與癌細(xì)胞增殖相關(guān)[9]。早在提出“紡錘體檢查點(diǎn)”概念前,微管穩(wěn)定劑之一的紫杉醇類藥物就已廣泛應(yīng)用于臨床,它們的主要作用靶點(diǎn)就是紡錘體檢查點(diǎn)。雖然這類藥物在臨床應(yīng)用上取得了巨大成功,但耐藥現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。相關(guān)研究指出紫杉醇類藥物的敏感性必須依賴于功能完整的紡錘體檢查點(diǎn)[10],因此,若想提高這些抗癌藥物的效能,就必須對(duì)紡錘體檢查點(diǎn)蛋白的功能進(jìn)行更為深入的研究。目前,該領(lǐng)域的研究是國(guó)際癌癥研究的熱點(diǎn)之一,國(guó)內(nèi)研究尚處于起步階段,文獻(xiàn)報(bào)道極少。

我們運(yùn)用RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)錄后水平特異性干擾SKOV3細(xì)胞中Bub1 mRNA的表達(dá),進(jìn)而降低了Bub1蛋白表達(dá)水平,隨后經(jīng)紫杉醇處理,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著下降,凋亡細(xì)胞明顯減少,由此初步證明Bub1在卵巢癌細(xì)胞化療耐藥中發(fā)揮了重要作用。有研究者推測(cè)紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷的細(xì)胞在紡錘體抑制因子持續(xù)或高劑量作用后,可不停滯于過渡期而變?yōu)槎啾扼w細(xì)胞,繼續(xù)存活;正常細(xì)胞則長(zhǎng)期停滯于該期,因紡錘體未及時(shí)修復(fù)而發(fā)生凋亡。我們?cè)赟KOV3細(xì)胞模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為上述研究提供了佐證。盡管如此,Bub1表達(dá)低下時(shí)哪些關(guān)鍵下游基因隨之變化,Bub1基因的下調(diào)是否直接影響紡錘體檢查點(diǎn)的功能,紡錘體檢查點(diǎn)的失活是否導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療耐藥,這些問題還有待于深入探討。值得注意的是,在不同的細(xì)胞系,紡錘體檢查點(diǎn)的功能呈現(xiàn)多元化的趨勢(shì),例如,我們的前期研究提示,在某些宮頸癌細(xì)胞株中,通過蛋白抑制劑破壞其紡錘體檢查點(diǎn)蛋白Bub1可增強(qiáng)紫杉醇的殺滅效能,故在這類細(xì)胞中運(yùn)用pEGFP-Bub1-shRNA載體抑制Bub1的表達(dá)亦可能增強(qiáng)宮頸癌輔助化療的敏感性。綜上所述,深入了解紡錘體檢查點(diǎn)蛋白功能對(duì)于探討紡錘體檢查點(diǎn)的作用機(jī)制和提高腫瘤細(xì)胞化療療效均具有十分重要的意義,而我們前期的相關(guān)工作為后續(xù)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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