秦紅斌,尹 衛(wèi),高惠波,陳大明,楊 志,祁本忠,金小海,白紅升,張文輝

(1.原子高科股份有限公司,北京 102413;2.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院,北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫(yī)學(xué)科,北京 100036)

123I由于其優(yōu)良的核素性質(zhì):發(fā)射159 keV的單能γ射線,適于SPECT顯像;半衰期只有13.2 h,可以降低對患者與工作人員的輻射損害[1],而成為放射性藥物研制中理想的核素之一。123I系高能加速器生產(chǎn)核素,以前在國內(nèi)應(yīng)用受到一定限制,但隨著高能加速器的市場化,123I的獲取更方便,使123I系列藥物逐漸成為當(dāng)今前瞻性診斷藥物研究的重要發(fā)展方向之一。單克隆抗體能識別特異抗原并與之結(jié)合,尤其能識別腫瘤抗原,單抗3H11與胃癌組織具有高陽性反應(yīng)率、高選擇性及高親和力的特點(diǎn),受到很多學(xué)者的廣泛關(guān)注。

目前用于 3H11標(biāo)記的核素主要有125I、131I、211At 、188Re、90Y 等,標(biāo)記物主要用于胃癌顯像或治療評價[2-9]。國內(nèi)用123I標(biāo)記單克隆抗體顯像的報(bào)道很少,也沒有用123I標(biāo)記胃癌抗克隆抗體3H 11的報(bào)道。本研究擬以123I作為顯像核素標(biāo)記單克隆抗體3H 11(McAb 3H 11),并對123I-3H11在正常鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行觀察,探討該標(biāo)記物作為診斷胃癌及胃癌轉(zhuǎn)移灶顯像劑的可能性。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

FT-603井型γ閃爍探頭-FH463A智能定標(biāo)儀:北京核儀器廠產(chǎn)品;AR2130型電子天平:美國OHAUS公司產(chǎn)品;單道可調(diào)移液器:美國Eppendorf公司產(chǎn)品;PD-10柱:瑞典 GE Healthcare公司產(chǎn)品;Whatman No.1試紙:英國Whatman公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

小鼠單克隆抗體3H 11:北京腫瘤研究所惠贈;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA):北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Na123I溶液:放射性濃度為 665 GBq/L,原子高科股份有限公司產(chǎn)品。其余試劑均為分析純,購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

正常昆明小鼠:15只,雌性,6～8周齡,體重18～22 g,SPF級,購自北京維科利華公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 123I-3H11標(biāo)記

采用 Iodogen法對 3H 11抗體進(jìn)行123I標(biāo)記。在底部涂敷10μg Iodogen的塑料小管中加入100μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、30μL 3H11(1 g/L溶于p H7.4 PBS中)、20μL約13.3 MBq的Na123I,以pH 7.4 PBS控制反應(yīng)總體積為150μL,室溫下不間斷勻速震蕩反應(yīng)8 min。將液體取出終止反應(yīng),加入100μL 0.01 mol/L PBS蕩洗反應(yīng)管,并將洗滌液合并入反應(yīng)液中。

2.2 標(biāo)記率的測定

采用薄層層析法分析標(biāo)記率。以Whatman No.1試紙為支持體,用 V(甲醇)∶V(水)=85∶15為展開劑。根據(jù)所得R f計(jì)算標(biāo)記率。

2.3 123I-3H11的純化

標(biāo)記產(chǎn)物采用PD-10柱純化,用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)淋洗。PD-10柱流速要求1 mL(20滴)/min,每分鐘接一管,測量各管放射性活度。采用2.2節(jié)測標(biāo)記率的方法測123I-3H11放化純度。

2.4 123I-3H11的體外穩(wěn)定性

取50μL純化后的標(biāo)記物分別加入到100μL以下 3種體系中:生理鹽水、PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)、人血清。以下三種環(huán)境:4 ℃、室溫 、水浴37 ℃下貯存,分別于2、24、48 h取樣,紙色層測定放化純度,觀察標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

2.5 123I-3H11在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布

選用雌性昆明小白鼠15只,隨機(jī)分為3組,每組5只。經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL123I-3H11(約1.11 MBq,比活度 40 GBq/g),于注射后 2、24、48 h眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。取心、肝、脾 、肺 、腎 、胃 、腸 、肌肉 、骨 、甲狀腺等組織稱重并測量其放射性計(jì)數(shù)。經(jīng)衰變校正后,計(jì)算每克臟器的放射性攝取占總注射劑量的百分?jǐn)?shù)(%ID/g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 123I-3H11標(biāo)記條件的優(yōu)化

3.1.1 Na123I活度對標(biāo)記率的影響 2.1節(jié)中,僅改變反應(yīng)體系中Na123I活度,觀察其對123I-3H11標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖1。由圖1可以看出,隨Na123I放射性濃度的增大,標(biāo)記率呈下降趨勢,2.3 MBq時最大,為92%;9.5和13.3 MBq時,標(biāo)記率約 80%。為保證所合成的123I-3H 11能達(dá)到一定的比活度,參與反應(yīng)的Na123I放射性活度不應(yīng)太小。本實(shí)驗(yàn)選用13.3 MBq。

圖1 反應(yīng)體系中Na123 I放射性濃度對標(biāo)記率的影響

3.1.2 氧化劑Iodogen用量對標(biāo)記率的影響僅改變2.1節(jié)中氧化劑用量,觀察其對標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖2。圖2表明,氧化劑Iodogen量小于10μg時,標(biāo)記率隨Iodogen量的增加而增大,但I(xiàn)odogen用量太少,其氧化能力不夠,不能使I-被充分氧化成I+;而在Iodogen用量大于40μg后,標(biāo)記率隨Iodogen用量的增加而降低,這主要是由于Iodogen量太多,氧化能力過強(qiáng),產(chǎn)生高價態(tài)的碘,導(dǎo)致標(biāo)記率減小。因此,選擇 Iodogen用量為 10μg。

圖2 Iodogen用量對標(biāo)記率的影響

3.1.3 緩沖溶液pH對標(biāo)記率的影響 2.1節(jié)中,改變緩沖溶液p H,其它條件保持不變,觀察p H對標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖3。由圖3可知,p H對標(biāo)記率有一定的影響,緩沖溶液pH為7.4～7.6時標(biāo)記率最高,約為80%。因此,選擇緩沖液的p H為7.4。

圖3 緩沖溶液p H對標(biāo)記率的影響

3.1.4 標(biāo)記反應(yīng)時間的選擇 按2.1節(jié)方法制備123I-3H11,在不同時間點(diǎn)測標(biāo)記率,結(jié)果示于圖4。由圖4可知,反應(yīng) 5 min,標(biāo)記率達(dá)到72%;繼續(xù)反應(yīng)到8 min時,標(biāo)記率達(dá)到76%;此后隨時間延長,標(biāo)記率不再有明顯變化。反應(yīng)時間延長對標(biāo)記率有一定的貢獻(xiàn),但會使單抗的活性降低。因此,選擇標(biāo)記時間8 min。

3.1.5 反應(yīng)體積對標(biāo)記率的影響 改變2.1節(jié)中反應(yīng)液的體積,觀察其對標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖5。由圖 5可知,反應(yīng)體積為50、150、1 000μL時,標(biāo)記率分別為 95.1%、89.3%、42.1%。該結(jié)果表明,碘化反應(yīng)標(biāo)記率與反應(yīng)體積有關(guān),增大反應(yīng)體積,標(biāo)記率呈下降趨勢。這是由于反應(yīng)體積小時,被氧化的123I-與單克隆抗體結(jié)合的概率大,標(biāo)記率高。但反應(yīng)體積小時有一個缺點(diǎn),即重現(xiàn)性差。原因可能是,每支反應(yīng)管中涂層Iodogen位置有差異,反應(yīng)液體積過小,不能全部蓋過涂層,使得每次反應(yīng)中實(shí)際參加的氧化劑量不同,氧化的123I-的量也不同,導(dǎo)致標(biāo)記率重現(xiàn)性差。但反應(yīng)體積過大,使單克隆抗體的濃度被稀釋,氧化后123I與抗體的取代反應(yīng)機(jī)率變小,標(biāo)記率低。綜合考慮后,選擇反應(yīng)體積為150μL。

圖4 反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響

圖5 反應(yīng)體積對標(biāo)記率的影響

3.1.6 反應(yīng)溫度對標(biāo)記率的影響 在2.1節(jié)方法中,改變反應(yīng)溫度,其它條件不變,觀察反應(yīng)溫度對標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖6。從圖6中可以看出,反應(yīng)溫度為0℃時,標(biāo)記率為70%;反應(yīng)溫度為10～20℃時,標(biāo)記率為73%±2%;反應(yīng)溫度升高到30℃,標(biāo)記率增加到78%。溫度較高易使單克隆抗體的活性下降,因此,選擇標(biāo)記反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

3.2 最佳條件下的標(biāo)記

根據(jù)上述條件實(shí)驗(yàn),選擇最佳標(biāo)記條件為:Iodogen 10 μg、PBS 的 p H 7.4、單抗 3H 11 30 μg、123I活度 13.3 MBq、反應(yīng)時間 8 min、室溫、總反應(yīng)體積150μL。在最佳條件下制備標(biāo)記物,采用薄層層析法分析標(biāo)記物,123I-3H 11的R f為 0.0～ 0.1;游離碘的R f為 0.7～ 0.9;標(biāo)記率78.9%;PD-10柱純化后放化純度為96.4%。

圖6 溫度對標(biāo)記率的影響

3.3 123I-3H11的體外穩(wěn)定性

123I-3H 11在不同體系中、不同溫度下的穩(wěn)定性分別示于圖7和圖8。由圖7可以看出,標(biāo)記物在人血清、生理鹽水和pH 7.4的PBS三種體系中,4℃下放置48 h,標(biāo)記物的放化純度仍大于92%,降低小于5%,表明標(biāo)記物在4℃環(huán)境下體外穩(wěn)定性較好。從圖8可以看出,同樣在上述三種體系中,37℃下放置48 h,標(biāo)記物的放化純度小于90%,降低大于5%。這說明低溫適宜此標(biāo)記物的保存。

圖7 123 I-3H11在 3種介質(zhì)中4℃貯存時的體外穩(wěn)定性◆——人血清;□——生理鹽水;▲——pH 7.4的 PBS

圖8 123 I-3H11在 3種介質(zhì)中37℃貯存時的體外穩(wěn)定性◆——人血清;□——生理鹽水;▲——pH 7.4的 PBS

3.4 正常鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布

123I-3H 11在昆明小鼠體內(nèi)的血液清除時間曲線示于圖9,主要臟器的放射性攝取率列于表1。由圖9可以看出,123I-3H 11血液清除較快,半清除時間為12.25±0.25 h。由表1數(shù)據(jù)可以看出,123I-3H11注入初期,血液的初始攝取較高,但清除較快;標(biāo)記物主要通過肝、腎排泄;123I有親甲狀腺的性質(zhì)。123I-從123I標(biāo)記物脫落的結(jié)果必然導(dǎo)致123I-在甲狀腺富聚。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,甲狀腺中放射性攝取較其它組織偏高,說明123I-3H 11在體內(nèi)有脫碘現(xiàn)象,脫落的123I-在動物體內(nèi)廣泛分布。文獻(xiàn)[10]報(bào)道24 h后123I-大部分經(jīng)尿排泄,剩下的主要定位于甲狀腺,所以游離123I-不會影響模型動物顯像。胃組織中有明顯的濃聚,這一結(jié)果與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的131I-3H 11動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。由于胃組織中有一定的靶細(xì)胞BGC823,全抗3H 11進(jìn)入動物體內(nèi),與靶細(xì)胞結(jié)合,一旦與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,抗體即可停留在腫瘤組織內(nèi),而其他組織內(nèi)的抗體或腫瘤組織內(nèi)的無關(guān)蛋白則很快排泄,這樣可降低本底,有利于模型動物顯像研究。全抗3H 11相對分子質(zhì)量較大,在體內(nèi)的動力學(xué)速度較慢,藥物在組織濃集的時間較長,一般大于24 h,而123I半衰期與全抗3H 11的代謝時間不相匹配。考慮可采用123I標(biāo)記 3H11 Fab片段做進(jìn)一步研究。

圖9 123 I-3H11在正常昆明小鼠中的血液清除曲線

表1 123 I-3H11在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物分布(,n=5)

表1 123 I-3H11在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物分布(,n=5)

血12.64±1.45 3.57±1.05 0.98±0.43甲狀腺 4.95±2.31 9.34±4.79 3.09±2.13肝7.23±2.31 2.97±1.01 0.68±0.32腎6.98±2.35 2.01±1.03 0.76±0.37肺4.96±1.43 1.25±0.67 0.57±0.21胃4.72±0.98 2.11±0.57 1.05±0.32脾4.41±1.32 2.41±0.87 0.78±0.31心3.39±1.04 1.05±0.56 0.69±0.21腸2.89±0.68 1.05±0.34 0.88±0.11骨1.51±0.98 1.13±0.64 0.72±0.21肉0.99±0.12 0.73±0.13 0.59±0.09

4 結(jié) 論

123I-3H 11的放化純度高,低溫下體外穩(wěn)定性較好;正常昆明小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)表明,標(biāo)記物血液清除較快,主要通過肝、腎代謝,胃組織對標(biāo)記物有表達(dá)。因此,123I-3H 11是值得進(jìn)一步研究的標(biāo)記物,有望成為胃癌SPECT臨床顯像劑。

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