羅 勇,湯財(cái)?shù)?李美華,宋家龍,陸平曄,杜曉寧

(上海化工研究院上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心,上海 200062)

15N是氮元素的穩(wěn)定同位素之一,可以用作示蹤元素,廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。15N標(biāo)記氨基酸和多肽是研究醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的重要工具,在蛋白質(zhì)的人工合成、判定生物活性物質(zhì)(多肽、蛋白質(zhì))的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥用機(jī)理等方面起著獨(dú)特的示蹤作用,其應(yīng)用越來(lái)越廣泛,市場(chǎng)前景良好[1]。L-胱氨酸和L-半胱氨酸均為含硫氨基酸,屬人體非必需氨基酸,在體內(nèi)均可由蛋氨酸轉(zhuǎn)變而來(lái)。其中,從L-半胱氨酸出發(fā)可生成谷胱甘肽(G-SH),由于其活性基團(tuán)巰基的存在,使之具有許多重要的生理功能,如整合解毒作用、增強(qiáng)肝功能、抗氧化作用和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等。L-胱氨酸同時(shí)也是多種硬蛋白質(zhì)如角質(zhì)蛋白的重要成分。

L-胱氨酸廣泛存在于動(dòng)物的毛、發(fā)、骨、角中,目前工業(yè)上主要采用生物化學(xué)方法,經(jīng)由蛋白質(zhì)(如毛發(fā))水解、分離、精制而成。L-胱氨酸的化學(xué)生產(chǎn)具有較大的難度,合成過(guò)程中需對(duì)巰基進(jìn)行保護(hù)和解保護(hù)[1-2]。此外,經(jīng)化學(xué)方法合成的通常為消旋的D,L-氨基酸,不具有光學(xué)活性,必須經(jīng)化學(xué)或酶法拆分以得到有光學(xué)活性的L型產(chǎn)物。

15N標(biāo)記的L-胱氨酸是研究蛋白質(zhì)代謝的重要示蹤劑之一,目前國(guó)際上僅ISOTOPE等少數(shù)公司能提供產(chǎn)品,價(jià)格昂貴,售價(jià)高達(dá)每克4 640美元。因此開(kāi)發(fā)15N標(biāo)記L-胱氨酸的制備工藝具有較好的學(xué)術(shù)意義和經(jīng)濟(jì)效益。

基于L-胱氨酸可在酸性溶液中還原為L(zhǎng)-半胱氨酸,L-半胱氨酸也可在堿性環(huán)境中氧化為L(zhǎng)-胱氨酸,本實(shí)驗(yàn)擬設(shè)計(jì)一個(gè)新的合成路線合成15N-L-胱氨酸。元素分析儀:美國(guó)PE公司;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司;Thermo Finingan TSQ/A ccela質(zhì)譜儀:美國(guó)熱電公司;MAT-271氣體同位素質(zhì)譜計(jì):西德菲尼根瑪特公司。

15NH4Cl:上?；ぱ芯吭荷a(chǎn);鄰苯二甲酸、丙二酸二甲酯、芐硫醇、三聚甲醛等皆為市售化學(xué)純或分析純?cè)噭?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

總體合成路線設(shè)計(jì)為三步:第一步先合成S-芐基-D,L-半胱氨酸;第二步,采用酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸,包括對(duì) S-芐基-D,L-半胱氨酸乙?；?、酶拆分和消旋化;第三步,對(duì)拆分后的S-芐基-D,L-半胱氨酸解保護(hù),脫除芐基后再經(jīng)氧化得到L-胱氨酸。

2.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成

1 主要儀器與試劑

WRS-1數(shù)字熔點(diǎn)儀:上海精密儀器有限公司;Bruker biospin AC-P200型核磁共振儀:德國(guó)Bruker公司;Nicolet FT-IR 6770紅外吸收光譜儀:美國(guó)Nicolet公司;Perkin-Elmer 240C

S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成采用經(jīng)過(guò)改進(jìn)的Gabriel方法,其合成路線示于圖1。鄰苯二甲酸鉀鹽(1)與溴代丙二酸二甲酯縮合得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2),其鈉鹽(3)再與芐基氯甲硫醚(4)反應(yīng)得到N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5),再經(jīng)水解得到S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)。

圖1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成路線

2.1.1 鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的制備

鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的合成參考文獻(xiàn)[3-4]。將NaOH溶液緩慢滴加到26.75 g(0.50mol)NH 4 Cl中,生成的 NH 3隨 N2氣流通入由83.1 g(0.50 mo l)鄰苯二甲酸和200m L水配成的懸濁液中。待NH 3完全被鄰苯二甲酸溶液吸收后,先于100℃下蒸除溶液中的水,然后緩慢升溫至200℃脫水,最后將溫度逐漸上升至300℃,冷卻得白色固體74.1 g。將上述制得的鄰苯二甲酰亞胺粗品溶于無(wú)水乙醇,于攪拌下緩慢滴加KOH的無(wú)水甲醇溶液,室溫下保持3 h,過(guò)濾,用無(wú)水乙醇洗滌3次,得鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)白色晶體88.9 g,收率96.1%。

2.1.2 鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)及其鈉鹽(3)的制備

將18.52 g(0.1 mol)N-鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)與23.90 g(0.1m ol)新鮮制備的溴代丙二酸二乙酯均勻混合,在110℃油浴中加熱1 h,冷卻后加水?dāng)嚢?反應(yīng)物變?yōu)楣腆w。將其轉(zhuǎn)移到研缽內(nèi)反復(fù)研磨,水洗抽濾后得到29.80 g(2),收率97.6%。將制得的產(chǎn)物(2)加熱溶解于100 m L甲苯中,加入2.75 g(0.12 mol)金屬鈉條,回流攪拌 3 h,沉淀經(jīng)甲苯洗滌,干燥,得30.7 g黃色產(chǎn)物(3),收率96.2%。

2.1.3 芐基氯甲硫醚(4)的制備

將49.7 g(0.40 mol)芐硫醇與40.5 g(0.45m ol)三聚甲醛在冰浴中冷卻,并用干燥過(guò)的HCl氣飽和,然后加入 70 g(0.63 m ol)CaCl2,再于室溫下保持24 h。過(guò)濾除去固體物質(zhì)后,母液用5 mol/L NaOH溶液洗滌3次,無(wú)水Na2 SO4干燥,過(guò)濾后,減壓(0.27 kPa)蒸餾,收集 102℃的餾分,得到芐基氯甲硫醚(4)21.1 g,收率30.5%。

2.1.4 N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)的制備

將5.00 g(0.015 3mol)鈉鹽(3)和2.70 g(0.015 6 mo l)芐基氯甲硫醚(4)和50 m L無(wú)水甲苯攪拌回流12 h,過(guò)濾。沉淀經(jīng)甲苯洗滌后,再用無(wú)水乙醇重結(jié)晶,得到產(chǎn)物(5)4.0 g,產(chǎn)率59.4%。產(chǎn)物(5)的熔點(diǎn)為79.5～80.4℃;1H NMR(CDCl3):1.28(t,6H,J=7.0 H z,—CH 3),3.55(s,2H, —C—CH 2—S—),3.70(s,2H,—S—CH2—A r),4.32(q,4H,J=7.0Hz,—OCH2—),7.10 ～ 7.27(m,5H,—C6H5),7.72～7.81(m,4H,—C6H4)。

2.1.5 S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)的制備

將4.0 g縮合產(chǎn)物(5)懸浮于25m L V(乙醇)∶V(水)=1∶1混合液中,于攪拌下逐滴加入20m L 5 mol/L NaOH,保持溫度55～60℃,攪拌1 h后,加入足量濃鹽酸酸化,加熱水解2 h后蒸干溶液,滴加少許NaOH溶液至溶液呈中性(剛果紅)。將得到的沉淀過(guò)濾,并懸浮于沸騰的95%乙醇中,趁熱過(guò)濾,冷卻后得到晶體狀S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)0.98 g,收率50.1%。產(chǎn)物(6)的熔點(diǎn):211～214℃;元素分析實(shí)測(cè)值(計(jì)算值,%):C 56.80(56.87),N 6.58(6.63),H 6.15(6.20);MS-EI(m/z,%):211.1(M+,10),91.1(100);IR(υ/cm-1,KBr):3 062(C —H,A r—H),2 934(O—H,—COOH),1 500,1 588(C —C,benzene),1 400(C=O,—COOH)。

2.2 氨基?；阜ú鸱諷-芐基-D,L-半胱氨酸

氨基?；阜ú鸱諷-芐基-D,L-半胱氨酸的化學(xué)過(guò)程示于圖2。

圖2 氨基酰化酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸的化學(xué)過(guò)程

2.2.1 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的(7)的制備

將6.0 g(0.028 4 mol)D,L-硫芐基半胱氨酸(6)溶于48m L 1 mol/LNaOH溶液中,于冰浴下逐滴滴加12 m L乙酸酐,保持2 h后,再用濃鹽酸酸化至pH 為2,經(jīng)抽濾、水洗、干燥,得到6.90 g白色固體(7),收率95.9%。熔點(diǎn):158.7℃。

2.2.2 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的拆分

[5-8]對(duì)產(chǎn)物(7)進(jìn)行拆分:將6.90 g(0.027 2m ol)上述制得的 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸溶于50 m L 1 mol/L NaOH溶液中,調(diào)節(jié)溶液的pH 約為8.0,將溫度控制在37℃,加入0.20 g氨基酰化酶,于輕微攪拌下保持30 h,再調(diào)節(jié)溶液的pH至5.5,4℃過(guò)夜,抽濾,洗滌后得到白色固體S-芐基-L-半胱氨酸(8),收率 82.6%。熔點(diǎn):213.6℃,比旋光[α]D=+19.4°(NaOH 濃度為1mol/L,20 ℃)。

2.2.3 N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸(8)的消旋

參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行消旋化:稱取3.0 g產(chǎn)物(8)溶于20 m L 2.5 m ol/L NaOH中,升溫至60～65℃,保溫1 h。逐滴加入20 m L乙酸酐,恒溫30m in,冷卻。用濃鹽酸將溶液酸化至pH=2,保持4℃過(guò)夜,沉淀物過(guò)濾烘干后用于二次拆分,可繼續(xù)得到白色固體(8)。經(jīng)二次拆分后,S-芐基-L-半胱氨酸(9)的拆分總收率為62%。

2.3 15N-L-胱氨酸(11)的制備

對(duì)N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸(9)進(jìn)行解保護(hù)/氧化,制備L-胱氨酸,其化學(xué)過(guò)程示于圖3。

圖3 對(duì)N-乙酰-S-芐基-L-半胱氨酸解保護(hù)/氧化得到L-胱氨酸的化學(xué)過(guò)程

在-50 ℃下,將 3.5 g(0.016 5 m ol)產(chǎn)物(9)加入到50m L液氨中,再緩慢加入小塊金屬鈉,維持藍(lán)色3～5 min不褪,空氣中蒸發(fā)除去液氨,加入50 m L水;調(diào)pH 至8,加入痕量FeCl3,通入空氣流氧化;經(jīng)亞硝酸鐵氰化鈉檢測(cè)確定無(wú)硫醚后,過(guò)濾干燥。得白色固體(11)1.29 g,收率:78.0%。熔點(diǎn):258℃。

2.4 15N-L-胱氨酸的豐度實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以15NH 4 Cl(10.20%15N)為原料,進(jìn)行L-胱氨酸合成的豐度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),具體合成方法如前所述。

3 結(jié)果與討論

由于穩(wěn)定同位素15N原料非常昂貴,衡量合成路線優(yōu)劣的主要因素是穩(wěn)定同位素原子的利用率、產(chǎn)物的生物活性和同位素豐度。其中,經(jīng)Gabriel法改良的丙二酸酯法是15N標(biāo)記氨基酸的重要合成方法。L-胱氨酸的巰基非?；顫?在合成過(guò)程中需對(duì)此加以保護(hù)。可供選擇的保護(hù)基有芐基、二苯甲基、三苯甲基等,其中芐基最為常用。因此,本工作采用芐基作為巰基保護(hù)基,將商業(yè)上較易獲得的芐硫醇引入,制得芐基氯甲硫醚,并作為合成前體。此外,經(jīng)化學(xué)合成方法得到的通常為消旋物,不具有光學(xué)活性,因此必須經(jīng)化學(xué)或酶法拆分得到L型產(chǎn)物,最后,再經(jīng)解保護(hù)過(guò)程脫除保護(hù)基,得到目標(biāo)產(chǎn)物15N標(biāo)記L-胱氨酸。

3.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸合成中的影響因素

在15N-L-胱氨酸的合成過(guò)程中存在多個(gè)關(guān)鍵合成步驟,對(duì)最終產(chǎn)物的收率影響很大。

3.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

在產(chǎn)物(2)的合成過(guò)程中,保持其他條件不變,僅改變油浴溫度,觀察溫度對(duì)產(chǎn)物(2)收率的影響,結(jié)果列于表1。由表1可知,在實(shí)驗(yàn)條件下,反應(yīng)溫度對(duì)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,在110～120℃溫度范圍內(nèi)可獲得良好的收率。隨著溫度進(jìn)一步升高(高于130℃),產(chǎn)物的熔程變寬,表明副產(chǎn)物增多,收率降低。

3.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

產(chǎn)物(5)的合成過(guò)程中,保持其他條件不變,僅改變反應(yīng)時(shí)間,觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物(5)收率的影響,結(jié)果列于表2。由表2可知,在實(shí)驗(yàn)條件下,反應(yīng)時(shí)間對(duì)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),產(chǎn)物收率顯著增加;12 h以后,進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間(16 h),反應(yīng)收率不再有明顯變化,因此,該步反應(yīng)時(shí)間以12 h為宜。

表1 反應(yīng)溫度對(duì)鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

3.1.3 水解時(shí)間對(duì)S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)收率的影響

在探索實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的水解時(shí)間是影響S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的重要因素。反應(yīng)按2.1.5進(jìn)行,在其他條件不變的情況下,只改變鹽酸水解的時(shí)間,考察水解時(shí)間對(duì)D,L-硫芐基半胱氨酸收率的影響,結(jié)果列于表3。由表3可知,隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),產(chǎn)品收率上升,2 h時(shí)收率最高,達(dá)50%,此后隨著水解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),產(chǎn)品收率略有下降。因此,實(shí)際水解時(shí)間應(yīng)控制在2 h。

表3 水解時(shí)間對(duì) S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的影響

3.2 氨基?；阜ú鸱諨,L-硫芐基半胱氨酸中的影響因素

將所制得的S-芐基-D,L-半胱氨酸進(jìn)行乙酰化,并采用氨基?；笇?duì)其進(jìn)行光學(xué)拆分,再將具有光學(xué)活性的S-芐基-L-半胱氨酸從拆分混合液中分離出來(lái)。為了提高拆分的收率,還需對(duì)未參與反應(yīng)的N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸進(jìn)行消旋化,進(jìn)行再次拆分。

在本研究過(guò)程中,先后通過(guò)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn),對(duì)影響氨基酰化酶法拆分N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸生成S-芐基-L-半胱氨酸的多種影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,找到了比較合適的工藝條件[11]:反應(yīng)物 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的量為5 g,pH為8.0,反應(yīng)溫度為37℃,酶用量為200 m g,反應(yīng)液總體積為50 m L,反應(yīng)時(shí)間為30 h。在此條件下,S-芐基-L-半胱氨酸拆分的單程收率達(dá)到45%,N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸回收率達(dá)到88%。經(jīng)過(guò)兩次拆分以后,S-芐基-D,L-半胱氨酸總的拆分收率達(dá)到62%。

3.3 保護(hù)基的脫除

解保護(hù)即脫除S-芐基-L-半胱氨酸上的保護(hù)基芐基。可供選擇的體系有HF體系[10]和Na/NH3體系。HF體系收率較高(90%),但HF氣體毒性大,對(duì)于實(shí)驗(yàn)裝置要求很高;Na/NH3體系收率相對(duì)較低(78%),操作相對(duì)容易,危險(xiǎn)性較小。因此在實(shí)驗(yàn)中選擇Na/NH3體系進(jìn)行解保護(hù)。由于L-半胱氨酸在中性和堿性溶液中易被氧化生成 L-胱氨酸,且 L-胱氨酸難溶于水,因此在解保護(hù)后,在痕量Fe3+的催化下,于近中性溶液中將L-半胱氨酸氧化為L(zhǎng)-胱氨酸。

3.4 產(chǎn)品的分析與表征

對(duì)于終產(chǎn)品進(jìn)行紅外分析,結(jié)果示于圖4。根據(jù)圖 4可計(jì)算 IR(υ/cm-1,KBr)得:2 980(O —H,—COOH),1 680(C=O,—COOH),1 590(N—H,—NH2),1 480(C—H,—NH2—),1 400(C—O,—COOH),1 110(C—N,—CH—NH2)。薄層層析鑒定表明,產(chǎn)物與L-胱氨酸標(biāo)樣具有相同的R f。比旋光度[α]D為-215°(c=1,1 m ol/L HCl,20 ℃),與標(biāo)樣在該條件下的比旋光度-220°很接近。在HPLC上檢測(cè)產(chǎn)物純度大于98%。元素分析,C6H12N2S2O4實(shí)測(cè)值(計(jì)算值):C 29.82%(29.99%),N 11.59%(11.66%),H 6.15%(6.13%)。

圖4 L-胱氨酸的紅外光譜

3.5 15N-L-胱氨酸豐度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

通過(guò)優(yōu)化合成方法,以NH 4Cl和芐基氯甲硫醚為前體進(jìn)行了L-胱氨酸的合成,總收率為13.9%,產(chǎn)物的化學(xué)純度和光學(xué)純度符合要求。在此基礎(chǔ)上,以15NH4Cl(10.20%15N)為標(biāo)記前體,進(jìn)行L-胱氨酸合成的豐度實(shí)驗(yàn),合成總收率13.5%,15N的豐度為10.18%,未出現(xiàn)同位素稀釋現(xiàn)象。

4 小 結(jié)

設(shè)計(jì)并完成了適合15N標(biāo)記的L-胱氨酸,以15NH4 Cl為起始原料,通過(guò)改進(jìn)的Gabriel方法得到S-芐基-D,L-半胱氨酸,再經(jīng)氨基酰化酶法拆分和解除保護(hù)后得到15N標(biāo)記L-胱氨酸。紅外、HPLC質(zhì)譜、元素分析等分析手段均確證了多種中間體和15N標(biāo)記L-胱氨酸的結(jié)構(gòu);以同位素原料計(jì)總產(chǎn)率為13.5%,所用工藝不會(huì)產(chǎn)生同位素稀釋,可以滿足商品化15N標(biāo)記L-胱氨酸及相關(guān)衍生物的合成。

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