覃建明 莫文電 譚忠謀

(1廣西河池市人民醫(yī)院，廣西河池市新建路 91號，547000;2廣西河池藥檢所)

老年咳喘片由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補(bǔ)骨脂制成，有滋陰壯陽、扶正固本的功效，可以提高免疫力，促進(jìn)病體康復(fù)，用于老年慢性支氣管炎及各種體虛癥。補(bǔ)骨脂含香豆精類、黃酮類、單萜酚類以及揮發(fā)油、皂苷、多糖、類脂等成分。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為香豆精類，在補(bǔ)骨脂中含量較高，故選取其作為定量指標(biāo)控制本品的質(zhì)量，采用高效液相色譜法測定其含量。

1 儀器、試劑與樣品

LC-10ATVP高效液相色譜儀;SPD-10AVP紫外檢測器;威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站。

補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用);老年咳喘片及缺補(bǔ)骨脂的陰性對照樣品由某藥廠提供;甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (Kromasil C18 5μm;250mm×4.6mm)，流動相:甲醇 -水 (55∶45);流速:1.0mL/min;檢測波長:246nm;柱溫 :30℃;進(jìn)樣量 :10mL;理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算應(yīng)不少于 4000，分離度應(yīng)不小于 1.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，加甲醇制成每 1mL各含 20μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品 10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取粉末約 2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 20mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率 160W，頻率 50kHz)40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 依照“2.3項(xiàng)”下方法制備陰性對照溶液。

2.5 空白試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各 10μL，分別注入液相色譜儀，在“2.1”色譜條件下測定，在老年咳喘片供試品色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)位置 (補(bǔ)骨脂素 tR=12.1min，異補(bǔ)骨脂素 tR=14.5min)上，確認(rèn)了補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的吸收峰，而陰性對照溶液無補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的吸收峰，故認(rèn)為無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂素對照品約9.4mg，異補(bǔ)骨脂素對照品約 9.2mg，精密稱定，置同一100mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取以上對照品溶液 0.5、1、2、5、10mL，分別置 10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取溶液各 10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以對照品進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素在 0.0470～0.9400mg范圍內(nèi)時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系;異補(bǔ)骨脂素在0.0460～0.9200mg范圍內(nèi)時(shí)，異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為:

補(bǔ)骨脂素:Y=7.1211×106X+5.1969×103(r=0.9999)

異補(bǔ)骨脂素:Y=7.1589×106X+5.1495×103(r=0.9999)

2.7 精密度試驗(yàn) 取一批樣品，按“2.3項(xiàng)”方法制備供試品溶液 1份，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件，連續(xù)測定 5次，計(jì)算含量。結(jié)果表明 5次測定結(jié)果的平均值為0.2503mg/g，RSD為 0.45%(n=5)。試驗(yàn)表明，本法的精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號:060406)，按“2.3項(xiàng)”方法制備供試品溶液 5份，再按“2.1項(xiàng)”下色譜條件平行測定，5份測定結(jié)果的平均值為25.25mg/片 ，RSD為 0.31%(n=5)。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.9 耐用性試驗(yàn) 取“2.7項(xiàng)”下供試品溶液用兩根不同廠家同類型色譜柱分別以流速為 0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min進(jìn)行測定。5份測定結(jié)果的平均值為 0.2658mg/g，RSD為 0.44%(n=5)。結(jié)果表明，本法的耐用性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對同一份供試品溶液(批號:051006)，分別在 0、1、2、4、6、12h測定次，共測定 6次，結(jié)果 6次測定結(jié)果平均含量為 0.2422mg/g，RSD為1.65%(n=6)。試驗(yàn)表明，在 12h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。

2.11 回收率試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂素 6.0mg，補(bǔ)骨脂素5.8mg，精密稱定，置 50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為加樣回收率試驗(yàn)用對照品溶液(每1mL含補(bǔ)骨脂素對照品 0.1200mg/mL，含異補(bǔ)骨脂素0.1160mg/mL，含補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素總量0.23600mg/mL)。精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的樣品(含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總量為 0.2506mg/mL)1.0g，共取 5份樣，分別精密加入上述對照品溶液1mL，再加甲醇 19mL，按 “2.3項(xiàng)”制備供試品溶液，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為 98.88%，RSD為1.66%(n=5)，結(jié)果表明回收率良好。見表 1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.12 樣品測定及含量限度的擬訂 按正文擬訂的含量測定方法，測定了本品 10批樣品中的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量，結(jié)果表 2。10批樣品中批號為 060401含量最高，為 80.05μg/片;批號為 060304含量最低，為 57.62μg/片;10批樣品平均含量為 73.44μg/片。在擬訂含量限度時(shí)，根據(jù) 10批樣品中含量測定結(jié)果的平均值，適當(dāng)降低，故擬訂本品每片含補(bǔ)骨脂以補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)和異補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)計(jì)，總量不得少于 60μg。

表2 樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測定結(jié)果(n=10)

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 參照《中國藥典》2005年版一部中“補(bǔ)骨脂”【含量測定】項(xiàng)[1]所使用的色譜柱填料，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，經(jīng)試驗(yàn)，達(dá)到分離測定的目的。

3.2 流動相的選擇 參照《中國藥典》2005年版一部中“補(bǔ)骨脂”【含量測定】項(xiàng)[1]所使用的流動相，采用甲醇 -水(55∶45)為流動相進(jìn)行分析，達(dá)到分離測定的目的，所以選擇甲醇 -水(55∶45)為流動相。

3.3 提取溶劑及條件的選擇 由于補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素易溶于甲醇、乙醇等溶劑，參照《中國藥典》2005年版一部中“補(bǔ)骨脂”【含量測定】項(xiàng)[1]供試品制備提取溶劑及提取方法，所以用甲醇作為溶劑超聲處理，可達(dá)到完全提取的目的。

3.4 提取時(shí)間的選擇 經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，超聲提取 40min已能夠提取完全。

3.5 測定波長的選擇 取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，分別加流動相使溶解，在紫外分光光度計(jì)上掃描，結(jié)果補(bǔ)骨脂素對照品在 246.2nm波長處有最大吸收，異補(bǔ)骨脂素對照品在 246.4nm波長處有最大吸收，故選擇 246nm為測定波長。

[1]中國藥典[S].一部，2005:129-130.