別小琳 王燦

(四川省食品藥品檢驗所,四川 成都 610036)

按照《中國藥典》2005年版的要求,所有藥品在進行微生物限度檢查之前,必須對所采用的方法進行驗證,確認該方法能消除藥品的抑菌作用,因此,我們對有一定抑菌作用的復(fù)方樟腦乳膏,建立了微生物限度檢查方法,并對方法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)方樟腦乳膏,批號070820,由四川省迪威藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn);枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003,均為第三代,由四川省藥檢所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

(1)取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml加9ml生理鹽水稀釋,細菌數(shù)約為50～100cfu?ml-1,做活菌計數(shù)備用。

(2)取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml加9ml生理鹽水稀釋,菌落數(shù)約為50～100cfu?ml-1,做活菌計數(shù)備用。

(3)取經(jīng)25℃培養(yǎng)1w的黑曲霉斜面培養(yǎng)物,加3～5ml生理鹽水洗下霉菌孢子,吸出菌液,取1ml加9ml生理鹽水稀釋,菌落數(shù)約為50～100cfu?ml-1,做活菌計數(shù)備用。

1.2.2 供試液制備

分別取樣品10g、5g、3g加 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,溶解,取上層液,分別作為1∶10、1∶20和1∶33的供試液。

表1 不同稀釋法的試劑配比

1.2.3 回收率測定

將相應(yīng)比例的供試液以及試驗菌液同時加入平皿中(具體見表1),立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,作為試驗組,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h觀察,記錄菌落數(shù)。每種菌液各制備2個平皿。同時作活菌組和相應(yīng)比例供試液對照組的菌落計數(shù)。并按照下式計算試驗組菌回收率。

試驗組菌回收率=[(試驗組菌落數(shù)-供試液對照菌落數(shù))/活菌組菌數(shù)]×100%

1.2.4 控制菌檢查法驗證測定

按常規(guī)檢查方法,分別取1∶10供試液 10ml,接種至 3瓶100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,其中一瓶加入1ml金黃色葡萄球菌菌液(50～100個?ml-1)作為陽性菌對照,一瓶加入1ml大腸埃希菌(50～100個?ml-1)為陰性菌對照,按金黃色葡萄球菌檢查法進行檢驗。同時做1∶33供試液的檢驗,取1∶33供試液33ml,接種至3瓶 200ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,按照上述方法進行金黃色葡萄球菌檢驗。

2 結(jié)果

2.1 菌回收率測定

結(jié)果見表2,顯示用常規(guī)法測定細菌、霉菌的回收率,大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的回收率均小于70%,改用培養(yǎng)基稀釋法重新進行驗證,顯示培養(yǎng)基稀釋法3測定的菌回收率均大于70%。

表2 不同測定復(fù)方樟腦乳膏菌回收率試驗

2.2 金黃色葡萄球菌控制菌檢查法驗證結(jié)果

金黃色葡萄球菌控制菌檢查法驗證結(jié)果見表3,顯示1∶10供試液檢驗中陽性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌。1∶33供試液檢驗中,陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌,陽性菌對照組檢出金黃色葡萄球菌。由以上結(jié)果可見,可以采用1∶33供試品溶液進行本品的金黃色葡萄球菌檢查。

表3 金黃色葡萄球菌控制菌檢查法驗證

3 討論

復(fù)方樟腦乳膏是具有一定抑菌作用的藥品,在選擇消除其抑菌作用的方法時,由于藥品本身的物理性質(zhì)所限,只能采用培養(yǎng)基稀釋法,而其它消除抑菌作用的方法則不可行。通過不同濃度的培養(yǎng)基稀釋方法的加菌回收比較,最終確認采用1∶33供試品溶液按培養(yǎng)基稀釋法(0.1ml?皿-1)進行試驗：用1∶33供試品溶液按培養(yǎng)基稀釋法(0.1ml?皿-1)進行細菌、霉菌檢查;采用供試品溶液(1∶33)33ml加入至相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基進行金黃色葡萄球菌(200ml?瓶-1)測定。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(S).一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：附錄70-79.

2 蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)[M].北京：華齡出版社,2007,209-227.