謝一舟 萬莉紅 蘇嵐 汪宇輝 劉延友 朱雨 王正榮△

(1.四川大學(xué)時間生物學(xué)衛(wèi)生部重點實驗室;2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室,四川 成都 610041)

藥物成癮是腦內(nèi)相關(guān)核團和細胞在藥物反復(fù)作用下發(fā)生適應(yīng)性變化的時間依賴過程。藥物成癮過程與學(xué)習(xí)記憶過程可能存在相同的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。行為學(xué)實驗表明二者作用于相同的腦區(qū),學(xué)習(xí)記憶過程中起關(guān)鍵作用的相關(guān)腦區(qū)(例如,海馬)參與成癮藥物的強化效應(yīng),最終通過cAM P反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB,cAMP-response element binding protein)調(diào)控相應(yīng)的靶基因改變細胞的可塑性[1]。CREB是目前研究最多的與成癮記憶密切相關(guān)的分子機制之一[2],大多數(shù)成癮藥物都可以通過直接或間接途徑增加多巴胺的釋放,然后通過作用于D1受體增加cAM P的釋放從而活化PKA,使CREB磷酸化調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)成癮藥物的行為效應(yīng)[3]。

本實驗我們試圖通過對與研究學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)海馬中CREB的mRNA以及蛋白表達與RACK 1 mRNA以及蛋白表達的關(guān)系,探求干擾RACK 1對慢性嗎啡成癮小鼠可能的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性ICR小鼠,4～6W,60只。控制飼養(yǎng)及實驗環(huán)境條件(溫度：22℃、濕度：55%、光照循環(huán)12：12),自由進食進水。

1.1.2 試劑

shRACK1和空質(zhì)粒由本實驗室汪宇輝博士合成,鹽酸嗎啡(四川醫(yī)藥總公司),Trizol(上海英俊生物技術(shù)有限公司),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成,序列見表1。

表1 引物序列

1.2.1 慢性嗎啡成癮小鼠模型建立

實驗前小鼠自由活動3d,確定小鼠的天然偏愛,并測定其CPP值。 第4d開始,以 2d為一周期,第 1d,10：00注射嗎啡(MIC MIR,10mg?kg-1)或者生理鹽水(CONC),并將小鼠置于白側(cè)適應(yīng)0.5h。次日10：00均注射生理鹽水,并將小鼠置于黑側(cè)0.5h,每天 16：00分別注射 shRACK1(M IR)和空質(zhì)粒(MIC,CONC)。持續(xù)8d,重復(fù)4周期后,進行CPP測試。

1.2.2 RT-PCR檢測RACK 1、CREB mRNA的表達

處死小鼠,快速取腦組織,冰上分離海馬組織,Trizol法提取組織總 RNA,分光光度計鑒定總 RNA。采用半定量RTPCR特異性擴增RACK 1和CREB mRNA,分析其表達水平。

1.2.3 免疫組化檢測RACK1、CREB蛋白的表達

用4%的甲醛溶液將海馬組織標本固定48h,等級脫水后石蠟包埋,切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟,3%H202室溫孵育15min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,熱抗原修復(fù)10min,室溫冷卻30min。10%正常山羊血清封閉15min,滴加1：100稀釋的一抗RACK1和BDNF,4℃過夜,生物素化二抗 37℃孵育 15min,滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,37℃孵育15min,DAB顯色劑顯色5min,蘇木素復(fù)染,封片。采用盲法請有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生對切片進行觀察并作半定量分析,以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞,每張切片在×400下隨機取10個視野,根據(jù)細胞染色的深淺和視野中顯色細胞所占的比例評分,兩項評分的乘積作為積分數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析方法

2 結(jié)果

2.1 shRACK1對小鼠CPP的影響

給藥前各組在白箱停留時間差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。建立模型后,B：空質(zhì)粒+嗎啡組(MIC)與A：空質(zhì)粒+生理鹽水組(CONC)相比,小鼠在白箱內(nèi)停留時間明顯增加(見圖1,＊p＜0.05);C：RACK1干擾質(zhì)粒+嗎啡組(MIR)與空質(zhì)粒+嗎啡組(MIC)相比,小鼠在白箱內(nèi)停留時間明顯減少(見圖1,#p＜0.05)。

圖1 各組小鼠條件性位置偏愛測試

2.2 shRACK1對小鼠海馬RACK 1和CREB mRNA表達的影響

空質(zhì)粒+嗎啡組(MIC)海馬中RACK 1和CREB mRNA的表達增高;而shRACK1+嗎啡組(M IR)海馬中 RACK 1和CREB mRNA的表達明顯降低(見圖2A)。經(jīng)RT-PCR所得條帶的(OD)值,,計算 Rtime1=ODRACK1/ODβ-actin,Rtime2=ODCREB/ODβ-actin。檢測出與 MIR和CONC組相比,MIC組中RACK 1和CREB mRNA表達明顯增高(p＜0.05)(見圖2B)。

2.3 shRACK1對小鼠海馬RACK1和CREB蛋白表達的影響

RACK1和CREB在生理鹽水對照組海馬的齒狀回和CA1區(qū)呈現(xiàn)弱陽性表達,shRACK1+嗎啡組(MIR)海馬的齒狀回和CA1區(qū)呈現(xiàn)強陽性表達,而RACK1干擾質(zhì)粒+嗎啡組(MIR)小鼠海馬的齒狀回和CA1區(qū)表達明顯降低,呈現(xiàn)弱陽性(見圖3)。

3 討論

CREB是分子量為43KD的蛋白質(zhì),定位于細胞核內(nèi),為DNA活性轉(zhuǎn)錄因子家庭中的成員之一,它能被蛋白激酶 A(PKA)磷酸化,是大腦內(nèi)一種主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。急性給藥,藥物可通過不同機制使相關(guān)腦區(qū)多巴胺(DA)含量增加,從而抑制腦內(nèi)多種類型神經(jīng)元內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶活性[4-7]。而慢性反復(fù)給藥,腦內(nèi)多種核團特別是邊緣中腦多巴胺系統(tǒng)相關(guān)核團則發(fā)生持續(xù)的對抗性適應(yīng)反應(yīng),包括cAM P信號通路、阿片類受體和DA受體活性、多種神經(jīng)元之間遞質(zhì)活動的相應(yīng)變化[8-13]。

早期的藥物成癮研究發(fā)現(xiàn),急性嗎啡使用會導(dǎo)致藍斑和伏隔核的p-CREB水平降低,然而這種效應(yīng)在慢性嗎啡成癮時徹底CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用可能是阿片類物質(zhì)導(dǎo)致藥物成癮產(chǎn)生的基因表達變化的分子信號通路的一個重要組成部分。慢性嗎啡給藥后,NAc中CREB的免疫活性降低,NAc中注射反義寡核苷酸后NAc中CREB免疫活性呈特異且持續(xù)的降低,反義寡核苷酸可以部分拮抗嗎啡的效應(yīng),提示CREB在神經(jīng)系統(tǒng)中可以自主調(diào)節(jié)cAM P通路[14-15]。CREB的調(diào)節(jié)及隨后的基因表達的變化可能是阿片類藥物引起的細胞內(nèi)長期適應(yīng)性變化的基礎(chǔ)。急慢性嗎啡給藥后CREB控制的基因的表達卻不同[16]。通過對信號級聯(lián)反應(yīng)通路的研究發(fā)現(xiàn),慢性嗎啡給藥導(dǎo)致不同腦區(qū)神經(jīng)細胞cAM P信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能上調(diào),PKA催化亞單位上調(diào);同時CaM-CamK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,鈣依賴性蛋白激酶上調(diào),使得細胞內(nèi)的CREB磷酸化而激活,與CREB結(jié)合蛋白(CRE)的結(jié)合活性增加,磷酸化后的CREB可以和CBP結(jié)合,共同作用于含有CRE調(diào)節(jié)序列。

本實驗建立慢性嗎啡成癮小鼠模型,用RT-PCR技術(shù)檢測RACK1和 CREB mRNA和蛋白表達水平,結(jié)果顯示干擾RACK1能夠使CREB表達量降低。從而確定了RACK1與慢性成癮之間的關(guān)系以及RACK1干擾質(zhì)粒慢性成癮的作用,并揭示了其作用機制在于阻斷了細胞內(nèi)的RACK1-CREB通路。

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