徐美榮 許建成 陳 云 周紹榮 池鳴鳴

甲狀腺腫瘤是較常見的內(nèi)分泌腺腫瘤，在總?cè)巳褐械陌l(fā)病率為4% ～7%，其中大多數(shù)為良性，惡性占腫瘤的5%，甲狀腺癌在所有惡性腫瘤中的死亡率約占1%;其中甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的1種類型;由于甲狀腺腫瘤多起病隱匿、進(jìn)展緩慢，一般良惡性腫瘤的癥狀和體征亦無明顯的區(qū)別，極易誤診，而且惡性腫瘤的惡性程度高低不一，治療方法也大不相同。雖然術(shù)前B超和細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAB)已廣泛用于術(shù)前診斷，但這種方法仍有很大的局限性，大約有15%～20%的細(xì)針穿刺組織在細(xì)胞形態(tài)上處于交界狀態(tài)，這時良惡性則難以鑒別;對于這類患者，因?yàn)槿狈γ鞔_的術(shù)前診斷和預(yù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)，所以難以確定腫瘤的具體分級及手術(shù)切除范圍，因此，尋找能夠幫助診斷和鑒別診斷甲狀腺乳頭狀癌的分子標(biāo)志物是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院、上海長海醫(yī)院和上海寶山區(qū)中心醫(yī)院、2007年3月～2008年10月手術(shù)切除的甲狀腺腫塊送病理冷凍切片組織103份，所有病例術(shù)前未經(jīng)任何化療和抗腫瘤治療。男性19例，女性84例，年齡14～70歲，中位年齡43歲。根據(jù)2004年WHO甲狀腺腫瘤病理分類［1］:甲狀腺乳頭狀癌41例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(結(jié)甲)19例，甲狀腺腺瘤35例和橋本氏病5例。同時將惡性病例按年齡、性別等分類。組織標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后，于－80℃超低溫冰箱保存、備用。

1.2 方法

提取組織中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(DT)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再引入基因引物或內(nèi)參基因引物在DNA聚合酶(Taq酶)作用下以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行凝膠電泳，在紫外光凝膠成像系統(tǒng)掃描并記錄。用凝膠圖像分析儀對圖像進(jìn)行掃描，用四星圖像處理系統(tǒng)，測定各組cDNA的特異性RNA表達(dá)量與內(nèi)參之間的比值代表mRNA豐度。

引物的設(shè)計(jì)，擴(kuò)增目的基因片段 RASSF1A［2］，CK19［3］，p53［4］和內(nèi)參 β-actin［5］的引物由 Primers 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)工程有限公司合成。

試劑:逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 K1622(Fermentas公司)，Premix Taq DRR003A(TaKaRa公司)，DNA Maker DL-2000 D501A(TaKaRa公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件，定性檢測陽性表達(dá)率的比較采用費(fèi)歇爾精確檢驗(yàn)(Fisher’s exact test);RASSF1A、CK19和p53相對表達(dá)量數(shù)據(jù)以±s表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson定性相關(guān);P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1AmRNA在各組織中表達(dá)情況

RASSF1AmRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達(dá)率為24.39%(10/41)，在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病中其陽性表達(dá)率分別為68.42%(13/19)、77.14%(27/35)和80.00%(4/5)(表 1)，甲狀腺乳頭狀癌與濾泡源性良性病變組織相比，其表達(dá)缺失率差異有顯著性(P＜0.05)，而3組良性病變間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

半定量RT-PCR顯示，RASSF1A在甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病組織中的相對表達(dá)量分別為 0.1789 ±0.0112、0.6437 ±0.0827、0.6563 ±0.0855、0.5243 ±0.1345。甲狀腺乳頭狀癌中其表達(dá)量與良性病變比較有顯著差異(P＜0.01)(表2，圖1)。

表1 RASSF1A mRNA在甲狀腺良惡性組織中的表達(dá)(例)

表2 RASSF1A mRNA在甲狀腺良惡性組織中的半定量表達(dá)±s)

表2 RASSF1A mRNA在甲狀腺良惡性組織中的半定量表達(dá)±s)

注:兩兩比較采用Scheffe法;①為a與b比較，②為a與c比較，③為b與c比較，④為a與d比較，⑤為b與d比較，⑥為c與d比較

組別 mRNA豐度 均數(shù)差 P值結(jié)節(jié)性甲狀腺瘤(a) 0.6437 ±0.0827 0.0126① 0.983①甲狀腺腺瘤(b) 0.6563 ±0.0855 0.1194② 0.135②橋本氏病(c) 0.5243 ±0.1345 0.1320③ 0.055③乳頭狀癌(d) 0.1789 ±0.0112 0.4648④ 0.000④0.4774⑤ 0.000⑤0.3454⑥ 0.000⑥

圖1 不同組織中RASSF1AmRNA表達(dá)情況

2.2 CK19mRNA在各組織中表達(dá)情況

CK19mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)率為82.61%(19/23)，在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病中陽性表達(dá)率分別為 37.50%(6/16)、17.24%(5/29)、20.00%(1/5)。甲狀腺乳頭狀癌與濾泡源性良性病變組織相比，表達(dá)缺失率差異有顯著性(P＜0.05)，而3組良性病變間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(表 3)。

半定量RT-PCR顯示，CK19mRNA在甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病組織中的相對表達(dá)量分別為1.1465 ± 0.1835，0.5529 ±0.0517，0.4219 ±0.0416，0.4837。甲狀腺乳頭狀癌中CK19mRNA表達(dá)量與良性病變組織比較有顯著性差異(P ＜0.01)(圖2)。

表3 CK19mRNA在甲狀腺腫塊組織中的表達(dá)情況(例)

圖2 不同病變組織中CK19表達(dá)

2.3 p53mRNA在各組織中表達(dá)情況

p53mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)率為41.46%(17/41)，在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病中陽性表達(dá)率分別為 15.79%(3/19)、5.71%(2/35)、0(0/5);甲狀腺乳頭狀癌與濾泡源性良性病變組織比較，其表達(dá)缺失率差異有顯著性(P＜0.05)，而3組良性病變組織間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(表 4)。

半定量RT-PCR顯示，p53mRNA在甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和橋本氏病組織中的相對表達(dá)量分別為 0.8024 ±0.1940，1.5393 ±0.2066，1.3913 ± 0.2152，1.5511 ± 0.2485，甲狀腺乳頭狀癌中其表達(dá)量與良性病變組織比較有顯著性差異(P ＜0.01)(圖 3)。

2.4 RASSF1A表達(dá)與CK19和p53表達(dá)的相關(guān)性

100例甲狀腺良惡性病變中，RASSF1A表達(dá)陽性，同時CK19表達(dá)陰性為36例;RASSF1A表達(dá)陰性，同時CK19表達(dá)陽性為30例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Pearson 點(diǎn)相關(guān)系數(shù)為 －0.3181，P=0.0013);RASSF1A 表達(dá)陽性，同時p53表達(dá)陽性為7例;RASSF1A表達(dá)陰性，同時p53表達(dá)陰性為31例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(Pearson 點(diǎn)相關(guān)系數(shù)為 0.2364，P=0.0179)(表 5)。提示RASSF1A、CK19和p53在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生中具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測更有利于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和鑒別診斷。

表4 p53mRNA在甲狀腺腫塊組織中的表達(dá)情況(例)

圖3 不同病變組織中p53mRNA表達(dá)

表5 RASSF1A表達(dá)與CK19和p53表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

甲狀腺癌主要由濾泡源性癌和C細(xì)胞源性的髓樣癌組成，前者有乳頭狀癌、濾泡狀癌和未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的1種類型。國際上公認(rèn)的甲狀腺乳頭狀癌的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)為:由含有纖維血管軸心的乳頭和由瘤細(xì)胞構(gòu)成的濾泡結(jié)構(gòu)組成，瘤細(xì)胞的細(xì)胞核大，染色質(zhì)淡染，呈毛玻璃樣，核仁不明顯，核膜增厚，核重疊，有時可見核溝及核內(nèi)包涵體，間質(zhì)中常伴有沙礫體形成［6］，但惡性腫瘤具有異質(zhì)性，有些甲狀腺乳頭狀癌并不具有上述特征，有些甲狀腺良性乳頭狀增生性病變也具有毛玻璃核。一些甲狀腺乳頭狀癌單憑HE染色難以與其他甲狀腺病變區(qū)別，因此尋找能幫助診斷和鑒別診斷甲狀腺乳頭狀癌的特異性標(biāo)志物很有必要。

2000年，Dammann等［7］采用酵母雙雜交篩選方法，首次在染色體3p21.3內(nèi)120 kb長的最小純合缺失區(qū)克隆出1種能與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用的基因，即RASSF1基因，主要有A、B、C 3種轉(zhuǎn)錄本，其中RASSF1A含1α、2αβ和外顯子3～6，其cDNA全長為1873 bp，編碼1個分子量為38.8 kD含有340個氨基酸的蛋白多肽。本研究通過檢測RASSF1A mRNA在甲狀腺乳頭狀癌和濾泡源性良性病變中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，23例甲狀腺乳頭狀癌中僅6例表達(dá)陽性，陽性率 26.09%，結(jié)甲、腺瘤和橋本氏病的RASSF1A陽性表達(dá)率分別為 68.75%(11/16)、75.86%(22/29)和 80.00%(4/5)，甲狀腺乳頭狀癌陽性表達(dá)率與濾泡源性良性病變比較有顯著差異;且半定量結(jié)果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)量明顯下降，但甲狀腺乳頭狀癌中RASSF1AmRNA的表達(dá)缺失率與患者年齡、性別、腫瘤大小和浸潤轉(zhuǎn)移均無明顯的相關(guān)性，提示RASSF1A基因可能是甲狀腺乳頭狀癌重要相關(guān)抑癌基因，參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展。

Cytokeratin 19是1個低分子量的角蛋白，是角蛋白家族中最小的酸性蛋白質(zhì)，屬于中微絲(Intermediate ferdament)蛋白家族，是上皮細(xì)胞骨架的一部分。國內(nèi)外研究認(rèn)為CK19的過度表達(dá)與肺癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［8，9］。最近，Tedgui等［10］利用組織芯片和免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CK19在80.9% 的甲狀腺乳頭狀癌中彌漫強(qiáng)表達(dá)，是診斷甲狀腺乳頭狀癌的有用標(biāo)記。

人類p53基因定位于17號染色體短臂1區(qū)3.1帶(17P13.1)，全長 16～20 kb，基因組有 11個外顯子，10個內(nèi)含子。p53基因具有進(jìn)化保守性，可在DNA復(fù)制水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生長，是細(xì)胞生長的重要的調(diào)節(jié)因子。

本實(shí)驗(yàn)通過定性相關(guān)性統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，100例甲狀腺良惡性病變中，RASSF1A表達(dá)陽性，同時CK19表達(dá)陰性36例;RASSF1A表達(dá)陰性，同時CK19表達(dá)陽性為30例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。RASSF1A表達(dá)陽性，同時p53表達(dá)陽性為7例;RASSF1A表達(dá)陰性，同時p53表達(dá)陰性為31例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)。提示RASSF1A、CK19和p53在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生中具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測更有利于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和鑒別診斷。

目前，甲狀腺癌的誤診和漏診臨床上不少見，致使部分甲狀腺良性腫瘤患者接受了不必要的過大手術(shù)，增加了一些不必要的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，而部分甲狀腺惡性腫瘤患者常因手術(shù)范圍不夠而需接受2次手術(shù)。因此尋找能夠幫助診斷和鑒別診斷甲狀腺乳頭狀癌的分子標(biāo)志物十分必要。本研究結(jié)果提示，RASSF1A、CK19和p53的檢測可作為良惡性甲狀腺濾泡源性腫瘤鑒別診斷的指標(biāo)之一，聯(lián)合檢測結(jié)果更可靠。

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