丁 罡 黃 騫 陳學(xué)進 劉合代

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移很大程度上依賴腫瘤血管形成［1，2］。血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞上的硌氨酸受體，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞分裂，增殖，向腫瘤細胞遷移，最后形成新生血管。大鼠脾內(nèi)移植肝轉(zhuǎn)移模型是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移實驗研究理性的動物模型［3］。本實驗通過該模型，觀察在大鼠脾內(nèi)移植瘤模型中VEGF表達與腫瘤血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Walker256癌肉瘤細胞株，由北京腫瘤研究所提供。Wistar雌性大鼠16只，體重(200±20)g，由上海斯萊克實驗動物公司提供［許可證號:scxk(滬)2007－0005］。分籠飼養(yǎng)，室溫 24℃ ～26℃，濕度 40% ～60%。

1.2 實驗方法

Wistar大鼠Walker256癌肉瘤脾內(nèi)移植后肝轉(zhuǎn)移模型的建立［3］:抽取Wistar大鼠的Walker256腹水瘤，臺盼藍排除法計活細胞數(shù)。用PBS調(diào)整瘤細胞濃度為 5 ×107/ml。氯胺酮(30 mg/100g)0.4 ml/只腹腔注射麻醉大鼠。在大鼠的右側(cè)腹部(脾區(qū))消毒后，剪開約1 cm的小口，暴露脾臟并固定，用4號針頭在脾的下極包膜下緩慢注入0.2 ml Walker256肉瘤細胞懸液。局部用凝血酶，明膠海綿壓迫止血，然后逐層縫合腹肌、皮膚。

動物血清標(biāo)本采集:在瘤株接種前后第2、14天，分別采取大鼠尾靜脈血0.5 ml，2 000 rpn室溫離心。取上清液200μl保存于－30℃。

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移分析:瘤株接種后第14天處死并解剖大鼠，觀察腫瘤重量、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶、腹腔轉(zhuǎn)移灶和腹腔積液情況。

微血管密度計數(shù)［4］:選用兔抗大鼠FactorⅧ進行免疫組織化學(xué)染色。兩位具有一定血管研究經(jīng)驗的人員觀察，先在100倍光鏡下尋找腫瘤中血管密度最高的5個區(qū)域，然后在200倍光鏡下計算微血管密度(MVD)。5個區(qū)域的均值為該腫瘤的微血管密度。腫瘤組織中任何黃染的細胞或細胞群都計算為1個MVD，位于匯管區(qū)的血管不計算。

免疫組織化學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，染色強度:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞數(shù):無陽性細胞數(shù)為0分，陽性細胞數(shù)＜10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～74%為3分，≥75%為4分。兩者乘積＞3分為免疫反應(yīng)(+)。按乘積分?jǐn)?shù):0分為(－)，1～3分為(±)，4～5分為(+)，6～7分為(++)，＞7分為(+++)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脾內(nèi)移植瘤模型血清VEGF表達與腫瘤血管形成的關(guān)系

大鼠脾內(nèi)移植瘤模型血清VEGF表達與腫瘤組織微血管密度、肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，γ=0.92 P＜0.05。肝轉(zhuǎn)移大鼠腫瘤組織中的微血管密度大于肝轉(zhuǎn)移陰性大鼠(86.82 ±11.39 vs 71.56 ±8.95，P ＜0.05)(圖 1)。

2.2 VEGF在轉(zhuǎn)移腫瘤中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，VEGF主要表達于腫瘤細胞胞質(zhì)，染色陽性。發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的脾臟腫瘤細胞VEGF胞質(zhì)染色較深。

2.3 大鼠移植瘤模型血清VEGF與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

大鼠移植瘤模型血清VEGF表達水平的變化見圖2。大鼠移植瘤模型中血清VEGF表達與肝轉(zhuǎn)移、腹腔播散和血性腹腔積液有關(guān)(表1)。

表1 大鼠腫瘤血清VEGF與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

圖1 大鼠血清VEGF與腫瘤微血管密度、肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系

圖2 大鼠移植瘤模型血清VEGF表達的變化

3 討論

腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移很大程度上依賴腫瘤血管形成。實體腫瘤生長到2～3 mm時，如果缺乏新生血管，腫瘤細胞即進入到休眠狀態(tài)，如果血管形成，進入腫瘤組織后，腫瘤組織的血供即由彌散變成灌注。兩天內(nèi)，腫瘤細胞由靜止?fàn)顟B(tài)開始加速生長，同時腫瘤周圍環(huán)境繼續(xù)血管化，血管形成，兩周內(nèi)腫瘤組織的體積可達原來19 000倍［6］。腫瘤血管為腫瘤細胞生長提供所需的營養(yǎng)，同時由于新生的腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能異常，例如血管壁不完整，缺乏基膜等，使得腫瘤細胞能穿透管壁，進入血循環(huán)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。

近年來，實驗中發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤血管形成正負調(diào)節(jié)因子。其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞上的硌氨酸受體，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞分裂，增殖，向腫瘤細胞遷移，最后形成新生血管，使腫瘤病灶的氧供由彌散變?yōu)楣嘧ⅲ瑸槟[瘤細胞的生長提供氧、營養(yǎng)、排泄、分解代謝產(chǎn)物［7］。通過增強血管通透性，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)滲到腫瘤病灶和血漿蛋白(纖維蛋白)滲出血管腔，沉積于周圍組織。有助于腫瘤血管形成和為腫瘤生長提供微環(huán)境［8］。血管形成為惡性腫瘤細胞進入血道發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。VEGF是已知作用最強、特異性最高的血管生長因子之一。

在實驗大鼠移植瘤模型中隨著大鼠血清VEGF濃度的升高，腫瘤組織中的微血管密度增大。并且肝轉(zhuǎn)移大鼠MVD高于肝轉(zhuǎn)移陰性大鼠。這與Takanamib報道的結(jié)果相似［9］，表明VEGF在一定程度上調(diào)控腫瘤血管形成。有實驗表明，腫瘤的血管形成及血管密度與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，從而影響腫瘤的預(yù)后［10，11］。

本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠接種瘤細胞24小時血清VEGF濃度明顯升高，在以后的兩周內(nèi)血清VEGF濃度保持相對穩(wěn)定的高水平，這是因為大鼠接種1×107個瘤細胞后，生長超過2～3 mm，此時腫瘤細胞生長須腫瘤血管支持［12］。腫瘤細胞即高度表達VEGF，使大鼠血清VEGF濃度明顯升高，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分裂、增殖、降解基膜、趨化、最終形成腫瘤血管。

實驗動物大鼠移植瘤模型出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移、血性腹腔積液、腹腔播散的血清VEGF濃度和免疫組化染色也明顯高于非侵襲和轉(zhuǎn)移的大鼠，這表明在腫瘤發(fā)展過程中，只有當(dāng)腫瘤細胞向侵襲、轉(zhuǎn)移方向發(fā)展時，釋放大量的VEGF，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。同時，檢測血清VEGF水平的變化在一定程度反映腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的傾向。

本實驗結(jié)果表明，在大鼠脾內(nèi)移植瘤肝轉(zhuǎn)移模型中，腫瘤細胞表達VEGF在腫瘤血管形成、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。檢測血清VEGF的表達有助于預(yù)測腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤預(yù)后判斷，為臨床針對VEGF靶點的抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供理論依據(jù)。

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