這兩年在講授人教版選修3《現(xiàn)代生物科技專題》的“基因工程”專題部分時(shí)，發(fā)現(xiàn)無論是部分老師，還是學(xué)生對(duì)其中的有關(guān)問題，都存在著或多或少的疑問，現(xiàn)收集教學(xué)一線碰到的以下問題逐一進(jìn)行解析，供同行參考。

問題1：在現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用中，利用最多的就是在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)真核蛋白，比如人胰島素和生長(zhǎng)激素。但是，真核基因的核基因序列卻很少直接用來做表達(dá)蛋白質(zhì)的工作，這是為什么?

解析：在細(xì)菌等原核細(xì)胞中，結(jié)構(gòu)基因通常指一個(gè)DNA片段，它可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA分子。mRNA分子通過翻譯合成細(xì)胞中所需的蛋白質(zhì)(圖1)。在真核細(xì)胞中，基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)要復(fù)雜一些(圖2)。真核基因的編碼區(qū)域(外顯子)往往被一些非編碼區(qū)域(內(nèi)含子)所分開，因此，在一個(gè)完整的真核基因轉(zhuǎn)錄以后，內(nèi)含子要被剪切刪除掉，再把外顯子連起來，這個(gè)過程稱為剪切，屬于轉(zhuǎn)錄后加工。剪切之后就能產(chǎn)生有功能的mRNA。遺憾的是細(xì)菌無法有效地去除內(nèi)含子，剪切連接外顯子。因此，真核基因的核基因序列很少直接用來做表達(dá)蛋白質(zhì)的工作。

人們一般都愿意把真核細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈的互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后再放到原核宿主細(xì)胞DNA調(diào)控序列的后面表達(dá)，從而簡(jiǎn)化它的轉(zhuǎn)錄以及翻譯過程。

問題2：如何通過cDNA方法獲得真核生物目的基因?

解析：cDNA合成過程大致如圖3所示。

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。

第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。

第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。

問題3：為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?

解析：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識(shí)別和切斷DNA上特定的堿基序列。細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因?yàn)槲⑸镌陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解掉。生物在長(zhǎng)期演化過程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵，達(dá)到保護(hù)自身的目的。

問題4：為什么在分子克隆實(shí)驗(yàn)中使用最普遍的是那些識(shí)別4個(gè)或6個(gè)堿基對(duì)的限制性內(nèi)切酶?

解析：限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)可以是4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、8個(gè)甚至更多的堿基對(duì)(表1)。由于限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子中出現(xiàn)的頻率不同，即識(shí)別位點(diǎn)序列短的限制性內(nèi)切酶就會(huì)更頻繁地切割DNA分子，因此，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中使用最普遍的是那些識(shí)別4個(gè)或6個(gè)堿基對(duì)的限制性內(nèi)切酶。

問題5：如何構(gòu)建基因文庫?

解析：在原核生物中，結(jié)構(gòu)基因通常會(huì)在基因組DNA上形成一個(gè)連續(xù)的編碼區(qū)域，但在真核細(xì)胞中，外顯子往往會(huì)被內(nèi)含子分開。因此在處理原核基因和真核基因的分離時(shí)，要分別采取不同的克隆步驟。

在原核細(xì)胞中，目的DNA通常在總的染色體DNA中的含量非常少(小于0.02％)。要克隆原核基因，首先要用限制性內(nèi)切酶對(duì)總DNA酶解，然后把這些酶解的DNA片段克隆轉(zhuǎn)進(jìn)載體，再對(duì)帶有外源DNA片段的重組克隆進(jìn)行鑒定、分離、再培養(yǎng)和進(jìn)一步鑒定。整個(gè)過程稱為基因文庫的構(gòu)建。從定義上講，一個(gè)完整的基因文庫應(yīng)該包括目的生物體所有的基因組DNA。

構(gòu)建基因文庫大多采用一種識(shí)別4個(gè)堿基序列的限制性內(nèi)切酶(如Sau3A I)進(jìn)行酶解，理論上講它應(yīng)該是每256個(gè)堿基就切一次，調(diào)整酶解反應(yīng)的條件可以使它部分酶解基因組DNA，產(chǎn)生出所有的可能大小的片段(圖4)。由于限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)在基因組DNA上并不是隨機(jī)排列的，有些片段可能會(huì)太大而無法克隆，這時(shí)文庫就不完整，要找到某一個(gè)特異的目的DNA片段也許就要難一些。

問題6：目的基因?yàn)楹伪仨毢瓦\(yùn)載體結(jié)合形成重組DNA才導(dǎo)人受體細(xì)胞?

解析：基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。要想使新的重組DNA分子在宿主細(xì)胞中保存下去，就要求這兩個(gè)不同來源的DNA分子中至少有一個(gè)分子必須提供其在細(xì)胞中保存下來所需的生物學(xué)功能，這個(gè)分子就是基因工程中常用的載體。

問題7：運(yùn)輸基因的載體上為何常帶有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因?

解析：運(yùn)載體上的特殊的遺傳標(biāo)記基因，可供重組DNA的鑒定與選擇。這里以外源DNA插入到pBR322的Barn HI位點(diǎn)中為例來加以說明：圖5是pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖：pBR322質(zhì)粒含有兩個(gè)抗生素抗性基因(抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素)；還有單一的Barn Hl、HindⅢ和Sal I的識(shí)別位點(diǎn)，這3個(gè)位點(diǎn)都在四環(huán)素抗性基因內(nèi)；另一個(gè)單一的Pst I識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)。pBR322帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，它可以保證這個(gè)質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復(fù)制功能。

轉(zhuǎn)化之后，就要對(duì)含有外源DNA的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。可以通過以下步驟來鑒別：先將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，只有那些帶有完整的pBR322質(zhì)粒或是插入有外源DNA片段的pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞可以在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會(huì)被氨芐青霉素殺死。由于Bam Hl位點(diǎn)是在四環(huán)素抗性基因中，因此，如果DNA插入到這個(gè)基因中，就會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，四環(huán)素的抗性就會(huì)丟失，所以帶有外源DNA的質(zhì)粒的受體細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素有抗性，但對(duì)四環(huán)素沒有抗性。那些帶有自身環(huán)化的質(zhì)粒DNA的細(xì)胞既有氨芐青霉素的抗性，同時(shí)也有四環(huán)素抗性。

第二步是把長(zhǎng)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的克隆轉(zhuǎn)移到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如果在含有四環(huán)素的平板上生長(zhǎng)，該克隆就帶有自身環(huán)化的pBR322，因?yàn)檫@些細(xì)胞對(duì)兩種抗生素都有抗性。而那些只在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)，而在四環(huán)素平板上不能生長(zhǎng)的克隆就是帶有外源DNA的重組質(zhì)粒的克隆。重復(fù)第二步篩選步驟，就可以較為確定地篩選出那些帶有特異地插入的外源DNA的重組質(zhì)粒。在pBR322質(zhì)粒上的HindⅢ和Sal I的位點(diǎn)也同樣可以作為克隆的位點(diǎn)。

問題8：天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎?為什么?

解析：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒，即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢?其實(shí)不然，作為基因工程使用的載體必須滿足以下條件。

(1)載體DNA必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插人而失活。

(2)載體DNA必須具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。

(3)載體DNA必須帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。

(4)載體DNA必須是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。

(5)載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。

實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。

問題9：轉(zhuǎn)基因技術(shù)中為什么常常選擇在動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白?

解析：人們之所以要選擇乳腺來生產(chǎn)藥物蛋白，原因很多。首先，乳汁可以由乳腺不斷地分泌，而且產(chǎn)量很高，長(zhǎng)期收集也不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成傷害；其次，將新的藥物蛋白限制在乳腺內(nèi)生產(chǎn)，最后分泌到乳汁中，一般不易對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常生理活動(dòng)造成影響。此外，乳腺分泌的蛋白質(zhì)是經(jīng)過正常的高等哺乳動(dòng)物的翻譯后加工的，這使得生產(chǎn)的藥物蛋白更接近于人類自身的蛋白質(zhì)。再有，乳汁中蛋白純化起來相對(duì)較為容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白質(zhì)也不多。

問題10：利用顯微注射法注入外源基因后培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠為什么并不都產(chǎn)生預(yù)期的性狀?

解析：由于微注射法所注射的DNA在宿主基因組中是隨機(jī)整合的，并且有可能發(fā)生多個(gè)拷貝插入同一位點(diǎn)的情況，因此轉(zhuǎn)入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，從而干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常發(fā)育和代謝。另外，有的外源基因的表達(dá)具有時(shí)間性，得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能只在一段時(shí)期內(nèi)表達(dá)外源基因；有些個(gè)體可能因基因插入位點(diǎn)不合適而無法表達(dá)產(chǎn)物；還有些個(gè)體基因拷貝數(shù)過多導(dǎo)致表達(dá)過量，干擾自身的正常生理活動(dòng)。因此，并不是所有的轉(zhuǎn)基因小鼠都能產(chǎn)生預(yù)期的性狀。由于這些原因，DNA微注射法的總效率還是比較低，但是這種方法仍然是目前獲得轉(zhuǎn)基因鼠的常規(guī)方法。

問題11：如何利用染色體上整合了外源基因的轉(zhuǎn)基因鼠獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠?

解析：將轉(zhuǎn)基因鼠之間進(jìn)行雜交，子代再配對(duì)雜交。根據(jù)孟德爾遺傳定律，將有1／4的可能獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠(轉(zhuǎn)入基因可以和正?；蛞粯臃蛛x)，如圖6所示。

問題12：Bt毒蛋白基因是目前世界范圍內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物使用最廣泛、最有潛力的一個(gè)抗蟲基因，但使用過程中也存在不少問題，首先，Bt毒蛋白基因的抗蟲譜窄，每一種毒素基因只能針對(duì)一類害蟲；其次，隨著轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因植物的大面積種植，給昆蟲造成很高的選擇壓力，可能很快會(huì)使昆蟲對(duì)此毒蛋白產(chǎn)生抗性。針對(duì)這些情況，人們可以采取哪些應(yīng)對(duì)措施?

解析：人們需要對(duì)大田種植轉(zhuǎn)基因作物后的昆蟲數(shù)量加以密切監(jiān)測(cè)，以便跟蹤了解抗性昆蟲的產(chǎn)生頻率。如果產(chǎn)生抗性昆蟲的頻率很高，那么最終可能會(huì)需要效力更強(qiáng)的蘇云桿菌原毒素，甚至需克隆其他的殺蟲基因來轉(zhuǎn)化植物。針對(duì)以上問題，人們采取了一些措施，主要包括以下5點(diǎn)：

(1)分離新的Bt毒蛋白基因?？瓜x基因越多，可供選擇的范圍就越廣。

(2)對(duì)Bt毒蛋白基因進(jìn)行分子改造，提高其表達(dá)量。如使用高效表達(dá)啟動(dòng)子，或者使用植物偏愛密碼子，或者對(duì)不同來源的Bt毒蛋白基因進(jìn)行人工拼接和重組。

(3)同時(shí)使用兩個(gè)以上的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，或?qū)t毒蛋白基因與其他抗蟲基因聯(lián)合進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。

(4)使Bt毒蛋白基因只在容易被害蟲侵染組織器官中特異表達(dá)，或者只在發(fā)育的某個(gè)階段，或受傷時(shí)表達(dá)，稱為降壓法，即降低對(duì)昆蟲的選擇壓力，以降低抗性昆蟲出現(xiàn)的頻率。

(5)用不同表達(dá)水平來控制。用Bt毒蛋白基因表達(dá)量很高的植物以殺死任何可能產(chǎn)生抗性的昆蟲，或用低致死量的轉(zhuǎn)基因植物抑制昆蟲生長(zhǎng)，以利于其他天敵對(duì)其捕食。

同時(shí)，在大田里種植轉(zhuǎn)基因抗蟲作物時(shí)，還可以考慮以下措施：

(1)輪換法：抗蟲基因作物與化學(xué)殺蟲劑交替使用，使毒素基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)昆蟲的選擇壓力間斷；

(2)避護(hù)法：轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物混播，使抗蟲昆蟲品系難以發(fā)展；

(3)淘汰法：在昆蟲抗性產(chǎn)生以前，淘汰此種抗蟲作物。