摘要 鑒于近年來基因敲除頻繁地出現(xiàn)在高中生物教材和試題中，又基于基因敲除與基因工程的聯(lián)系以及基因敲除的廣泛的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)基因敲除作了簡(jiǎn)單的探討。

關(guān)鍵詞 基因敲除 基因工程 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

中圖分類號(hào) Q-49

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 E

科學(xué)界曾預(yù)言，21世紀(jì)是一個(gè)基因工程世紀(jì)。所謂基因工程(轉(zhuǎn)基因技術(shù))，又稱基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)，誕生于20世紀(jì)70年代，是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)?！盎蚯贸笔窃?0世紀(jì)80年代悄然誕生并發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，字面上看與轉(zhuǎn)基因相反，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)是導(dǎo)入某個(gè)基因，而基因敲除是切除某個(gè)基因，實(shí)質(zhì)上并不是如此簡(jiǎn)單，很大程度上，基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)有相似性，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理是基因重組，而基因敲除主要也是應(yīng)用DNA同源重組原理。

1 “基因敲除”在高中生物教材中的出現(xiàn)

浙科版教材，選修三《現(xiàn)代生物科技專題》一書的第52頁(yè)中第二段第二行，出現(xiàn)了“基因敲除”四個(gè)字，書本原話：“胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行基因敲除，獲得基因敲除動(dòng)物，如用基因敲除手段可以獲得適合人體移植的豬器官，減弱或消除排斥反應(yīng)?！?/p>

2 基因敲除的概述及方法

2.1基因敲除概述

基因敲除自20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種定點(diǎn)修飾基因組的新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)，其與體細(xì)胞核移植技術(shù)的成功結(jié)合，已經(jīng)成為一種有效的定點(diǎn)修飾、改造大動(dòng)物基因組DNA片段的實(shí)驗(yàn)策略。或者說基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾、改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。它克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。20世紀(jì)80年代初，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)試驗(yàn)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。1987年，Thompson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。

簡(jiǎn)單的說基因敲除是指將目標(biāo)基因從基因組中刪除。舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子：比如有一段“序列”：“1234567890”(原基因)，敲除后為“1237890”，一般一個(gè)敲除載體還會(huì)在其中插入一段外源基因，如“ABC”，則新的基因?yàn)椤?23ABC7890”，或者不插入基因直接連接，則為“1237890”。

通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和RNAi，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。在基因敲除技術(shù)中涉及到的變異類型有：基因重組、基因突變、人工誘變。

2.2實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法

利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除。此方法依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法。第一步是構(gòu)建基因載體；第二步是獲得Es細(xì)胞(同源的胚胎干細(xì)胞)；第三步是同源重組，將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入Es細(xì)胞中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中。從而得以表達(dá)。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。

利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除。此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。

RNAi引起的基因敲除。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中，所以RNAi的反應(yīng)過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡(jiǎn)便的方法。

3 基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及前景

3.1建立生物模型

模型生物的建立在基因功能、代謝途徑等研究中非常重要。基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細(xì)胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體，最常見的是小鼠、家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等。

3.2疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療

通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響。這無論是對(duì)了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義。目前基因敲除技術(shù)在Ⅱ型糖尿病研究和在腎素一血管緊張素系統(tǒng)研究中有了普遍和深入的應(yīng)用。

3.3提供廉價(jià)的異種移植器官

眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因?yàn)楫愒瓷锏幕驎?huì)產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來巨大的福音。如：PPL Therapeutics公司于1999年成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α-1，3GT基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生α1－3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的2個(gè)拷貝。這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應(yīng)則不會(huì)再發(fā)生。

3.4免疫學(xué)中的應(yīng)用

同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì)有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的相應(yīng)基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人用異源抗體的生產(chǎn)問題。

3.5改造生物、培育新的生物品種

細(xì)菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個(gè)重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持。

3.6微生物代謝工程方面的應(yīng)用

利用基因敲除技術(shù)可阻斷細(xì)胞的代謝旁路，或通過引入突變位點(diǎn)改變目的產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量而達(dá)到調(diào)節(jié)代謝流，優(yōu)化代謝途徑的目的。

4 基因敲除技術(shù)的缺陷

隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T可以提供同樣的功能；另一方面，對(duì)于某些必需基因，敲除后會(huì)造成細(xì)胞的死亡，也就無法對(duì)這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究。

基因敲除技術(shù)的誕生可以說是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對(duì)基因靶位時(shí)間和空間上的操作更加明確，效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)等學(xué)科提供一個(gè)全新的、強(qiáng)有力的研究和治療手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。