西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西交 710004)

王勝昱* 孫秀珍 盧家美 張 明 吳媛媛

支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)最常見的慢性呼吸道疾病,無地域和種族的局限性,也無年齡和性別的差異。它具有慢性反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn),嚴(yán)重者可危及生命。然而由于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,并且相關(guān)研究涉及到人體時(shí)會(huì)受到種種限制,因此有關(guān)病因的確定、發(fā)病機(jī)制的探索、新治療方法的評(píng)價(jià)、新藥的研究與開發(fā)在相當(dāng)程度上均需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,故制備哮喘動(dòng)物模型可在一定程度上達(dá)到研究目的。從氣傳致敏花粉種類中調(diào)查發(fā)現(xiàn),藜草是我國(guó)許多地方夏秋季節(jié)大氣中最常見的氣傳致敏花粉之一[1]。孫秀珍等[2]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者藜草花粉 ID及 sIgE陽性率在 40%以上。因此,構(gòu)建藜草花粉致敏的哮喘動(dòng)物模型為今后研究藜草花粉過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制和探索新的治療手段打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1 動(dòng)物與試劑 清潔級(jí)健康 BALB/c小鼠 40只,3～4周齡,雌性,體重 16±2g,購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,按隨機(jī)數(shù)字法分為:①空白對(duì)照組、②低劑量組、③中劑量組、④高劑量組,每組 10只,并用苦杏仁酸標(biāo)記。藜草花粉由本實(shí)驗(yàn)室采摘并保存;氫氧化鋁凝膠有本實(shí)驗(yàn)室自制;IL-4、IFN-γ、IgE、IgG1(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

2 藜草花粉粗制變應(yīng)原誘導(dǎo)小鼠肺部變態(tài)反應(yīng)模型的的建立 空白對(duì)照組腹腔注射 PBS100 μ l加氫氧化鋁 2mg,低劑量組腹腔注射 100 μ g/100 μ l藜草粗制變應(yīng)原加氫氧化鋁 2mg致敏,中劑量組腹腔注射200 μ g/200 μ l藜草粗制變應(yīng)原加氫氧化鋁 2mg致敏,高劑量組腹腔注射 300 μ g/300 μ l藜草粗制變應(yīng)原加氫氧化鋁 2mg致敏。第 9、17天后加強(qiáng)致敏方法劑量同前。在第 25天空白對(duì)照組用 PBS代替變應(yīng)原滴鼻激發(fā) ,低劑量組采用 100 μ g/10 μ l藜草變應(yīng)原激發(fā) ,中劑量組采用 200 μ g/20 μ l藜草變應(yīng)原激發(fā),高劑量組采用300 μ g/30 μ l藜草變應(yīng)原激發(fā) ,每天 1次 ,連續(xù) 3d。最后1天滴鼻后 24h進(jìn)行以下檢查。

3 氣管肺泡灌洗(BAL)及取血 小鼠麻醉后,眼窩取血,收集到 Eppendorf管中,3000 rPmin離心20 min,血清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的 Eppendorf管中,-20℃保存。氣管切開和氣管插管,注入 PBS 0.4ml,灌洗 3～ 4次,灌洗液回收率＞ 80%。 BALF經(jīng)900rPmin離心 10min后,在 1 h內(nèi)作細(xì)胞分離,上清液于-20℃儲(chǔ)存,作細(xì)胞因子測(cè)定。

4 BALF中細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類 取離心后的沉淀細(xì)胞,用 PBS洗兩次,稀釋成 1 ml懸液,將細(xì)胞懸液混勻后加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。另取 0.2ml于潔凈光滑載玻片上涂片,以瑞氏染液染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類,數(shù) 300個(gè)細(xì)胞,求出各類細(xì)胞的百分比。

5 BALF中 IL-4的濃度測(cè)定 IL-4的測(cè)定按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。即每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或待測(cè)樣品 100 μ l,將反應(yīng)板充分混勻后置 37℃孕育120min,用洗滌液洗板 4～6次,向?yàn)V紙上印干。加入酶標(biāo)抗體工作液 100 μ l,將反應(yīng)板充分混勻后置 37℃孕育 30min,洗滌液洗板 4～ 6次,加入底物工作液100 μl,置 37℃暗處反應(yīng) 15min,加入 100 μl終止液終止反應(yīng),30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在 450nm處測(cè)吸光值。所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品 2000、1000、 500、 250、 125、 62.5、 31.2、 0 pg/ml為橫坐標(biāo) ,OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品 OD值在該曲線圖上查出相應(yīng) IL-4含量。

6 BALF中 IFN-γ的濃度測(cè)定 IFN-γ的測(cè)定按 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。即每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或待測(cè)樣品 100 μ l,將反應(yīng)板充分混勻后置 37℃孕育 120min,用洗滌液洗板 4～6次,向?yàn)V紙上印干。加入酶標(biāo)抗體工作液 100 μ l,將反應(yīng)板充分混勻后置37℃孕育 30min,洗滌液洗板 4～ 6次,加入底物工作液 100 μ l,置 37℃暗處反應(yīng) 15 min,加入 100 μ l終止液終止反應(yīng),30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在 450nm處測(cè)吸光值。所有 OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、 62、31、0 pg/ml為 橫坐標(biāo) ,OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品 OD值在該曲線圖上查出相應(yīng) IFN-γ含量。

7 肺組織學(xué)檢查 打開胸腔,分離并取下肺組織,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。肺臟再以 10%中性甲醛灌注固定 24h,石蠟包埋,常規(guī)切片,進(jìn)行支氣管、肺組織HE染色,以檢測(cè)肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);根據(jù)Underwood的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分,根據(jù)血管周圍和氣道周圍細(xì)胞浸潤(rùn)情況不同分為 0～ 5分。

8 血清中特異性 IgG11mg/ml的變應(yīng)原粗浸液用 pH9.6的包被液稀釋至終濃度為 10 μ g/ml,加入100 μl/孔到 96孔板中,4℃過夜。 用 PBST(含 0.05%tween)洗板 5次 ,加入封閉液 100 μ l/孔 ,37℃孵 育120min,再用 PBST洗板 5次。將各組小鼠血清按一定比例稀釋,分別加入 100 μ l/孔已包被粗制變應(yīng)原的 96孔酶標(biāo)板中,37℃孵育 120min,用 PBST洗液洗板 5次,每孔加入已稀釋的 HAM A-Ig G1(1∶2000),37℃孵育 120min,PBST洗板 5次,加入含 0.5mg/ml鄰苯二胺(OPD)的磷酸-檸檬酸緩沖液,37℃避光顯色20min,加入終止液終止反應(yīng),30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

9 血清中特異性 IgE 1mg/ml的變應(yīng)原粗浸液用 pH9.6的包被液稀釋至終濃度為 10 μ g/ml,加入100 μl/孔到 96孔板中,4℃過夜。 用 PBST(含 0.05%tween)洗板 5次 ,加入封閉液 100 μ l/孔 ,37℃孵 育120min,再用 PBST洗板 5次。將各組小鼠血清按一定比例稀釋,分別加入 100 μ l/孔已包被粗制變應(yīng)原的 96孔酶標(biāo)板中,37℃孵育 120min,用 PBST洗液洗板 5次,每孔加入已稀釋的 HAM A-IgE(1∶1000),37℃孵育 120min,PBST洗板 5次,加入含 0.5mg/ml鄰苯二胺 (OPD)的磷酸-檸檬酸緩沖液,37℃避光顯色20min,加入終止液終止反應(yīng),30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

10 脾組織勻漿 IL-4和 IFN-γ的產(chǎn)生 將處死的免疫小鼠浸入 75%乙醇中消毒 2～3s,置超凈臺(tái),再次局部消毒皮膚,無菌條件下摘脾,并依次在 4°條件下研磨、PBS沖洗、用 RIPA裂解液裂解,并在 4°下4000r/m離心 10min,取勻漿液上清。用 ELISA方法測(cè)定 IL-4和 IFN-γ,方法同前。

結(jié) 果

1 肉眼觀察 空白對(duì)照組小鼠體重較前增加,食欲 精神好,皮毛光亮,眼睛明亮,大小便正常,無死亡。致敏小鼠后普遍煩躁,聚集成堆,活動(dòng)減少,可看見腹式呼吸,并且隨著劑量增加小鼠反應(yīng)明顯強(qiáng)烈,1～2d后恢復(fù)正常。在高劑量組中有兩只小鼠死亡。

2 病理變化 見表 1及圖 1～5。小鼠肺組織炎癥病理評(píng)分按低、中、高劑量組依次增高。低、中、高劑量組模型組與空白對(duì)照組比較,血管周圍和氣管周圍存在明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組小鼠支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主,大量炎癥細(xì)胞向小支氣管和血管遷移,上皮細(xì)胞部分有脫落,肺泡內(nèi)有水腫,且有黏液上皮化生。中、低劑量組中炎性細(xì)胞數(shù)量及其分類明顯低于高劑量組。而空白對(duì)照組氣管結(jié)構(gòu)無明顯改變,小鼠支氣管黏膜上皮 黏膜肌層基本完好,支氣管管腔規(guī)則,周圍無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

表1 小鼠肺組織病理評(píng)分(分)

3 BALF中細(xì)胞學(xué)變化 見表 2。 BALF以巨噬細(xì)胞為主,低、中、高劑量組中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、及淋巴細(xì)胞比例均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。表明藜草花粉可誘導(dǎo)氣管炎癥反應(yīng)。

4 BALF中 IL-4和 IFN-γ的測(cè)定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發(fā)后,BALF中IL-4含量明顯升高,而 IFN-γ明顯下降,(P＜0.05)。提示 BALF中 Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生,抑制 Th1型細(xì)胞因子分泌。

5 血清中特異性 Ig E和 Ig G1測(cè)定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發(fā)后,小鼠產(chǎn)生抗原特異性 IgE和 IgG1,與空白組相比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明藜草花粉粗制變應(yīng)原能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性 Ig E和 IgG1。

6 脾組織勻漿 IL-4和 IFN-γ的測(cè)定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發(fā)后,脾組織中IL-4含量明顯升高,而 IFN-γ明顯下降(P ＜0.05)。表明藜草花粉粗制變應(yīng)原能誘導(dǎo)小鼠脾臟產(chǎn)生 Th2型細(xì)胞因子,抑制 Th1型細(xì)胞因子分泌。

表2 肺泡灌洗液中細(xì)胞學(xué)改變

討 論

支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性氣管炎癥性疾病。引起氣管炎癥的是由肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞以及 50余種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與、相互作用的結(jié)果。盡管近年來對(duì)支氣管哮喘的研究已進(jìn)入分子和細(xì)胞水平,國(guó)際上對(duì)其防治也制定了規(guī)范化指導(dǎo)文件,但全球許多國(guó)家和地區(qū)哮喘的患病率和病死率均呈上升趨勢(shì)。

目前已制備出多種變應(yīng)原的動(dòng)物模型。 Huston等[3]首先用 OVA制成豚鼠吸入致敏的哮喘模型。Carvalho等[4]在大鼠皮下接種熱凝結(jié)的 OV A小片段,2～ 3周后用聚合 OV A氣管內(nèi)激發(fā)。這一方法不用佐劑,不需加強(qiáng)免疫,能夠產(chǎn)生發(fā)作期氣管高反應(yīng)性(AHR)并誘導(dǎo)持續(xù)的氣管 EOS浸潤(rùn)和活化,且具有類似人類哮喘的 Th2獨(dú)特型的肺組織病理學(xué)改變,其缺點(diǎn)是不具備哮喘患者在非發(fā)作期持續(xù)的 AHR。Carr等[5]給麻醉狀態(tài)下的小鼠鼻內(nèi)接種 15 μ l包含1000EID50的 A型流感病毒,接種 4d后觀察到氣管內(nèi)有多種炎癥細(xì)胞聚集,并可見氣道上皮細(xì)胞廣泛變性。Konno等[6]給 BALB/C小鼠氣管內(nèi)滴注 LPS發(fā)現(xiàn)支氣管平滑肌對(duì)乙酰膽堿的反應(yīng)性顯著升高。Ray等[7]將豚鼠在麻醉狀態(tài)下行氣管插管,給予 CO2機(jī)械過度通氣發(fā)現(xiàn)氣管阻力增加,肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降。我國(guó)研究者遲磊等[8]則另辟奚徑,在大鼠兩側(cè)腹股溝、腹、前足趾皮下注射 OVA成功地建立大鼠支氣管哮喘模型。另有郝敏麒等[9]將屋塵螨 Dep1和 Dep2用 PBS稀釋為 1g/L從而用較少量的螨取液建了 BALB/c小鼠塵螨支氣管哮喘模型。

小鼠的免疫及遺傳背景較為清楚,品系純正,可用于小鼠的免疫學(xué)及分子生物學(xué)試劑來源廣泛齊全。小鼠本身的價(jià)格相對(duì)低廉,所需試劑的量相對(duì)較少,易于喂養(yǎng),操作方便且一個(gè)人可獨(dú)立完成。因此,實(shí)驗(yàn)中使用小鼠變應(yīng)性疾病的模型越來越多。不同品系小鼠對(duì)OVA的免疫反應(yīng)亦不同,BALB/c小鼠致敏后可產(chǎn)生高滴度的 IgE,C57BL/6小鼠只產(chǎn)生低滴度的IgE[10]。本實(shí)驗(yàn)選用了 BALB/c小鼠構(gòu)建哮喘模型,通過對(duì)小鼠腹腔注射和滴鼻激發(fā)不同劑量藜草花粉粗制變應(yīng)原,從肺組織病理變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織變態(tài)反應(yīng)炎癥逐漸加重,巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞隨抗原劑量增加而增加,表現(xiàn)為氣管和血管周圍出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。BALF中細(xì)胞學(xué)變化顯示:小鼠 BALF存在大量炎癥細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞隨抗原劑量增加而增加,其病理變化與人類過敏性哮喘的病理變化有一定相似。

此外我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)個(gè)別老鼠肺部炎癥反應(yīng)不明顯,支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞分類嗜酸性粒細(xì)胞不高,可能與老鼠周齡在入組時(shí)偏差有關(guān)。黃華瓊等[11]研究證實(shí)小鼠越在生命早期經(jīng)過敏原激發(fā),肺部炎癥和氣管高反應(yīng)性越容易產(chǎn)生;而周齡過大的小鼠肺部炎癥反應(yīng)則不明顯。支氣管哮喘的特征是 Th1型淋巴細(xì)胞反應(yīng)與 Th2型淋巴細(xì)胞反應(yīng)的失衡。 Th1型淋巴細(xì)胞主要分泌 IFN-r等細(xì)胞因子,Th2型淋巴細(xì)胞主要分泌 IL-4,IL-5等細(xì)胞因子。Th2型細(xì)胞因子分泌增多,誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞聚集,合成 IgE抗體增多,使 Th1型淋巴細(xì)胞應(yīng)答受到抑制。在我們的研究中,高劑量組的脾組織勻漿與肺泡灌洗液中 IL-4明顯高于其他組,而 IFN-r卻顯著降低;血中特異性 Ig E和 IgG1顯著上升均表明藜草花粉粗制變應(yīng)原成功誘導(dǎo) Th2型淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過制備藜草花粉粗制變應(yīng)原,腹腔注射與滴鼻激發(fā)兩種方式成功構(gòu)建 BALB/C小鼠變態(tài)反應(yīng)氣管炎癥動(dòng)物模型,必將會(huì)對(duì)以后研究藜草花粉所致過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制、病理生理及其免疫治療打下基礎(chǔ)。

(本文圖片見封3)

圖1 高劑量組小鼠肺組織內(nèi)有明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)(HE×400)

圖2 高劑量組小鼠肺組織內(nèi)可見肺泡內(nèi)水腫(HE×100)

圖3 高劑量組小鼠肺組織內(nèi)可見上皮化生(HE×400)

圖4 中劑量組炎性細(xì)胞明顯低于高劑量組(HE×400)

圖5 低劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯低于高劑量(HE×100)

圖6 對(duì)照組小鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)完好,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(HE×100)

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