南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市醫(yī)院泌尿外科(蘇州 215001)

樊游掌 謝建軍 蘇懷慶 沈 華 邵 強

依達拉奉(Edaravone)化學(xué)名為 3甲基 1苯基 2吡唑啉 5酮,作為一種氧自由基清除劑,對組織器官的缺血再灌注損傷有保護作用,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于急性腦缺血再灌注損傷的治療[1]。腎移植過程中,存在著不同程度的移植腎缺血再灌注損傷,且這一過程早期能夠?qū)е乱浦材I功延遲恢復(fù)(Delayed graft function,DGF)以及急性排斥的發(fā)生,一旦發(fā)生常需要移植術(shù)透析治療,增加病人住院時間。氧自由基是參與缺血再灌注損傷重要因素之一。本研究就依達拉奉對腎移植的早期是否能抑制活性氧分子(Reactive oxygen species,ROS)的激活,從而對移植腎具有保護作用進一步探討。

材料與方法

1 實驗動物與分組 健康成年雄性 SD(Sprague-dawley)大鼠 36只(河南省實驗動物中心提供),體重 250±20g,溫暖通風條件下普通飼料喂養(yǎng)。隨機分為 3組,假手術(shù)組(Sham),正常移植組(I/R),依達拉奉移植組,每組 6例。術(shù)前 12h禁食不禁水。

2 試劑與儀器 手術(shù)顯微器械及醫(yī)用無損傷縫合線 9-0(寧波市成和顯微器械廠),雙人雙目顯微鏡(鎮(zhèn)江醫(yī)用光學(xué)儀器廠);MDA和 SOD試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。依達拉奉注射液由南京先聲東元制藥有限公司提供。

3 動物模型的建立 假手術(shù)組(A):0.3%戊巴比妥鈉,按 1 ml/100 g腹腔注射麻醉;腹部正中切口,分離兩側(cè)腎臟血管后,切除右側(cè)腎臟,結(jié)扎右側(cè)輸尿管殘端后關(guān)腹。正常腎移植組(B):常規(guī)消毒麻醉后。游離供鼠左側(cè)腎臟及輸尿管,并留膀胱瓣。陰莖背靜脈注射125 U/ml肝素 0.5ml進行大鼠全身肝素化。 4℃ HCA液高掛 50cm從腹主動脈原位連續(xù)灌注。待腎靜脈流出清亮液體,腎臟變?yōu)辄S白色時摘取左腎,4℃冷藏3h。受體切除雙腎后,將供腎與左腎動靜脈殘端作兩定點間斷吻合,動脈 8～ 10針,靜脈 16針左右。供腎膀胱瓣與受體膀胱壁行端端三定點間斷吻合。腹腔用溫熱的生理鹽水沖洗 2～3次復(fù)溫。分層關(guān)閉腹腔。依達拉奉干預(yù)移植組(C):移植方法同正常移植組,移植腎動靜脈吻合成功后,開放動靜脈并立即從大鼠腰靜脈注入依達拉奉 2mg/kg(濃度 10mg:5ml)。

4 指標的檢測

4.1 移植腎功能的檢測 大鼠移植后 24h,從腰靜脈取血 1ml,4℃ 1500r/min,5min離心后取血清,送至本院檢驗科自動生化儀檢測 Scr,BUN。

4.2 腎小管損傷積分 腎組織病理切片及腎小管損傷標準評分:術(shù)后 24 h摘取移植腎,送本院病理科常規(guī)切片 HE染色。切片由另一觀察者對腎小管壞死程度進行評分:每張標本切片在 200倍鏡下取外髓質(zhì)部 10個視野,依序觀察左上、右上、左下、右下、中間;按 0正常,1輕微損傷(受損腎小管 ＜5%),2輕度損傷(受損腎小管 5%～25%),3中度損傷(受損腎小管 25%～ 75%),4重度損傷(受損腎小管＞ 75%)作半定量分析并計算其平均值。作為腎小管壞死的標準評分指數(shù)[2]。

4.3 血清及移植腎組織丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)檢測 移植腎恢復(fù)血供后 24h,取腹主動脈血 2ml,4℃ 1500r/min 5min后備檢測 MDA及SOD;摘取移植腎,取少量腎組織加生理鹽水于玻璃勻漿管中制成 10%組織勻漿待檢。用比色法檢測血清及腎組織勻漿的 MDA和 SOD濃度。

結(jié) 果

1 移植腎腎功能的影響 移植后 24h,依達拉奉移植組肌酐水平較正常移植組明顯降低(P＜0.05);而 BUN水平也相應(yīng)下降,但兩組無顯著性差異(P＞0.05)。

2 腎小管損傷及損傷標準評分 雙盲統(tǒng)計腎小管損傷程度并積分,結(jié)果顯示兩移植組損傷積分較假手術(shù)組明顯升高,而依達拉奉移植組的積分明顯低于正常移植組(P＜0.05)。

3 血清及腎組織 MDA,SOD的影響 見附表。每組內(nèi) MDA,SOD活性在血清中與在腎組織中呈一致性變化;依達拉奉移植組 MDA水平較正常移植組明顯下降(P＜0.05),而 SOD活性較正常移植組明顯升高(P＜0.05)。

附表 大鼠移植腎各組觀察指標

附表 大鼠移植腎各組觀察指標

注:與 A組比較,*P＜0.05;與 B組比較,▲P＜0.05

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討 論

腎移植過程中,缺血再灌注損傷是不可避免的過程,能夠影響到移植腎短長期的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸。移植腎缺血再灌注過程中,血管內(nèi)皮細胞及中性粒細胞釋放產(chǎn)生大量自由基,氧化包括細胞膜、核膜、線粒體膜、溶酶體膜等生物膜上的不飽和脂肪酸,生成大量脂質(zhì)過氧化物,最終裂解成 MDA在內(nèi)的許多終未產(chǎn)物,進一步損傷細胞的功能,或直接導(dǎo)致細胞的壞死與凋亡,加速形成慢性移植物腎病[3]。因此,在移植腎缺血再灌注過程中,抑制活性氧分子系統(tǒng),將會減輕移植腎的損傷。

依達拉奉不僅能夠清除羥自由基,而且能夠清除鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[4,5];目前已經(jīng)證明,其可通過消除自由基,改善大腦梗死、心肌梗死的組織損傷程度[6～8]。大鼠腎臟實驗?zāi)Ｐ脱芯恐?依達拉奉能夠增加冷保存24h后再灌注腎臟的尿量及肌酐清除率[9],減少腎小管ROS的產(chǎn)生,緩解 45min熱缺血的腎功能[10];在順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性腎衰模型中,依達拉奉可以逆轉(zhuǎn)腎組織損傷后谷光甘肽的減少,緩解保護腎功能[11]。Tahara等也證實,依達拉奉能夠減輕狗自體移植腎的 72h冷缺血再灌注損傷,明顯提高移植狗腎存活率,增加移植后尿量及腎小球濾過率,改善腎小管的損傷程度,降低移植腎血管的阻力[12]。而對于大鼠同種異體腎移植早期 ROS的影響目前沒有報道。

在器官移植中,ROS在冷缺血、熱缺血以及再灌注過程中產(chǎn)生,并且通過損傷蛋白、脂質(zhì)、核酸從而損傷移植器官的功能。一些實驗顯示,在缺血再灌注過程中,人們可以從抑制 ROS的毒性中受益,一項豬自體腎移植的研究表明,被稱為 U74389G的氧自由基清除劑,能夠明顯減輕遭受 30min熱缺血及 24h冷保存的移植腎缺血再灌注損傷,并且提高相應(yīng)的存活率[13]。

MDA來自于多不飽和脂肪酸的過氧化過程,MDA的水平反應(yīng)脂質(zhì)過氧化程度;Doi等研究顯示,依達拉奉可以明顯減低大鼠腎臟熱缺血后 ROS產(chǎn)物[10]。 Tanaka等研究表明,狗自體腎移植后 1h,MDA濃度明顯升高,且免疫組化顯示,ROS的另一終產(chǎn)物4-HNE呈一致性變化,腎小管上皮細胞發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化[14]。本組結(jié)果也同樣顯示了依達拉奉移植組在同種異體腎移植 24h后,血清及腎組織中的 MDA水平明顯降低。 SOD屬于金屬酶,其活性中心含過渡金屬 Cu、Zn、Mn或 Fe,主要功能是催化超氧離子的歧化反應(yīng),使超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧分子,從而清除氧自由基。Nakagawa等[15]的研究提示,SOD在腎臟缺血再灌注損傷過程中,對血管內(nèi)皮細胞的保護發(fā)揮重要的作用。本研究顯示,依達拉奉能夠提高腎移植大鼠全身與移植腎局部的 SOD水平,減輕移植腎缺血再灌注損傷。

總之,在大鼠同種異體移植腎模型中,依達拉奉能夠通過在全身與局部,抑制 MDA以及增強 SOD活性,減輕 ROS系統(tǒng)代謝終產(chǎn)物對移植腎臟的損傷,改善同種異體移植腎術(shù)后 24h的腎功能。

[1] Higashi Y.Edaravone for the treatment of acute cerebral infarction: role of endothelium-derived nitric oxide and oxidative stress.Expert Opin Pharmacother,2009,10(2):323-331.

[2] Kengo F,Takashi W,Yasunori I,et al.Administration ofFR167653, a new anti-inflammatory compound,prevents renal ischaemia/reperfusion injury in mice.Nephrol Dial Transplant,2002,17(3):399-407.

[3] Kim J,Seok YM,Jung KJ.Reactive oxygen species/oxidative stress contributes toprogression of kidney fibrosis following transient ischemic injury in mice.Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(1):158-166.

[4] Watanabe T,Yuki S,Egawa M,et al.Protective effects of MCI-186 on cerebral ischemia:possible involvement of free radical scavenging and antioxidant actions. J Pharmacol Exp Ther,1994,268(3):1597-1604.

[5] 程 健.依達拉奉在大鼠失血性休克中保護機制的研究.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(6):654-656.

[6] 李安泰,白 燕,劉 娟.依達拉奉治療進展性腦梗死 30例.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(8):1062-1063.

[7] 王秦川,高 英,王惠霞.依達拉奉治療急性腦梗死 48例.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2007,36(8):1053-1055.

[8] Zhang YM,Wang Y,Liu XH.Cardioprotective effect of edaravone pharmacologicalpostconditioning on acute myocardial ischemia/reperfusion injury:experiment with rats.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2008,88(36):2558-2561.

[9] Masaki Y,Kumano K,He N,et al.Protective effects of M CI-186on cold kidney preservation/reperfusion injury in the rat.Transplant Proc,1996,28(3):1885-1886.

[10] Doi K,Suzuki Y,Nakao A,et al.Radical scavenger edaravone developed for clinical use ameliorates ischemia/reperfusion injury in rat kidney.Kidney Int,2004,65(5):1714-1723.

[11] Sueishi K,Mishima K,Makino K,et al.Protection by a radical scavenger edaravone againstcisplatin-induced nephrotoxicity in rats.Eur J Pharmacol,2002,451(2):203-208.

[12] Tahara M,Nakayama M,Jin M B,et al.A radical scavenger, edaravone,protectscaninekidneysfrom ischemia-reperfusion injury after 72 hours of cold preservation and autotransplantation. Transplantation,2005,80(2):213-221.

[13] Garvin PJ,Niehoff ML,Robinson SM.Renoprotective effects ofthe21-aminosteroid U74389G in ischemiareperfusion injury and cold storage preservation.Transplantation,1997,63(2):194-201.

[14] Tanaka H,Zhu Y,Zhang S.Lazaroid U-74500A for warm ischemia and reperfusion injury of the canine small intestine.J Am Coll Surg,1997,184(4):389-396.

[15] Nakagawa K,Koo DD,Davies DR,et al.Lecithinized superoxide dismutase reduces cold ischemia-induced chronic allograft dysfunction.Kidney Int,2002,61(3):1160-1169.