第四軍醫(yī)大學(xué)西京腦科醫(yī)院(西安 710032) 高大寬 章 翔 蔣曉帆 董文鵬 程 崗

大鼠大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型為缺血性腦損傷基礎(chǔ)研究中的常用動物模型。但隨著局灶性腦缺血 /再灌注的研究逐步向基因領(lǐng)域的延伸,并鑒于絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游飦碓从谛∈?因此迫切需要建立一種小鼠局灶性腦缺血 /再灌注模型,以便于在基因水平進行腦缺血 /再灌注損傷的病理生理改變的分子機制,預(yù)后及藥物治療作用的研究。

材料與方法

1 實驗動物及試劑 雄性 Balb/C小鼠,體重 25～30g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。戊巴比妥鈉購自北京化學(xué)試劑公司;齒科用硅膠樹脂及硅膠樹脂硬化劑購自德國 Heraeus Kulzer公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(T TC)購自 美國 Sigma公司;8-0尼龍纖維單絲購自比利時 Johnson公司。其他耗材及儀器設(shè)備由全軍神經(jīng)外科研究所提供。

2 腦缺血再灌注模型的制作[1]小鼠 2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,仰臥位固定,頸部中線切口。分離小鼠左側(cè)頜下腺體翻向外側(cè),在小鼠左側(cè)肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌和二腹肌形成的三角的內(nèi)側(cè)可見頸總動脈搏動,分離并暴露左側(cè)的頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈,依次在近心端結(jié)扎頸總動脈,在遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動脈,并離斷頸外動脈遠(yuǎn)端。沿頸內(nèi)動脈向深部繼續(xù)分離暴露翼腭動脈后,還需繼續(xù)向深部游離一段頸內(nèi)動脈。于頸外動脈近心端預(yù)留結(jié)扎線。采用小型無創(chuàng)血管夾同時夾閉翼腭動脈及遠(yuǎn)端頸內(nèi)動脈。于頸外動脈遠(yuǎn)心端用顯微剪刀剪一小口,插入制備好的線段(8個 0的單絲線,長約 11mm,前 3/4均勻包被一層硅膠,最終直徑約 200 μ m左右,而且尖端要圓鈍),轉(zhuǎn)過頸總動脈分叉,進入頸內(nèi)動脈。必須在直視下見線段插入頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)端,才能松開血管夾,繼續(xù)插入線段。否則,線段可能誤入翼腭動脈,從而導(dǎo)致模型失敗。插入線段直至遇到阻力,深度以過頸總動脈分叉 8～9mm為宜,即線段外露 1mm左右,此時線段頭端正好插入大腦前動脈或者大腦中動脈約 1mm。插線結(jié)束后,將預(yù)先放置于頸外動脈的結(jié)扎線縛緊,以防止線段滑出和出血。頸部傷口常規(guī)縫合。手術(shù)時間約為 10～15min。棄去手術(shù)超過 15min或手術(shù)中有出血及麻醉過深的動物。 MCAO時間分別為 30min、60 min、90 min及 120 min后,再次麻醉小鼠,分離暴露頸外動脈,松開固定線,拔除線段,電凝頸外動脈,并松開頸總動脈結(jié)扎線。直視下見頸總動脈和頸內(nèi)動脈搏動良好,即可實現(xiàn)再灌注。

3 神經(jīng)病學(xué)評分 按照 Longa的 5分法評分標(biāo)準(zhǔn)[2]稍加改進,手術(shù)后 24h進行評分。0分:無神經(jīng)缺損癥;1分:提尾時右前肢內(nèi)收,不能完全伸直;2分:行走向右傾倒;3分:向右旋轉(zhuǎn);4分:不能自己行走或昏迷。1～ 4分為有效模型。

4 腦梗死灶大小的計算 術(shù)后 24h斷頭取腦,置于小鼠腦冠狀切片磨具中,切成 2mm厚片。將切片置于 2%紅四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中,避光染色30min后,置于 10%多聚甲醛中固定。白色為梗死灶,紅色為正常腦組織。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死面積。根據(jù)公式 V=t×(A1+A2+…+An)算出梗死體積。其中 t為切片厚度,A為每個切片尾側(cè)梗死面積,n為單個鼠腦的切片數(shù)。本實驗中 t=2mm,n=4。

5 組織病理學(xué)觀察 術(shù)后 24h,2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,開胸暴露心臟,用生理鹽水心臟沖洗后,用 0.1mol/lPBS配制的 4%多聚甲醛(pH7.2～ 7.4)灌注,斷頭取腦,置于相同灌注液 12h后依次脫水、透明、浸蠟及包埋,行 5 μ m厚冠狀切片,進行 HE染色。

6 統(tǒng)計學(xué)處理 本組實驗數(shù)據(jù)以 x-±s表示,組間對比采用單因素方差分析、t檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,以 P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 小鼠腦缺血 /再灌注不同時間神經(jīng)病學(xué)評分

小鼠于手術(shù)后 50min內(nèi)緩慢蘇醒,逐漸恢復(fù)反射和自主活動。24h對各組小鼠進行神經(jīng)功能評分。假手術(shù)組未見異常。MCAO 30min和 60 min未能引起小鼠明顯的神經(jīng)功能障礙,而 MCAO 90 min及 120 min可引起小鼠明顯的神經(jīng)功能障礙,小鼠均出現(xiàn)對側(cè)肢體癱瘓,尤其是前肢。提尾懸空時,右前肢屈曲、內(nèi)收不能伸直,自主活動時身體向右側(cè)傾倒,以右后腿為圓心向右旋轉(zhuǎn),右前肢壓在腹下與左前肢交叉成剪刀狀。經(jīng)神經(jīng)功能評分統(tǒng)計分析證實,MCAO 120min組神經(jīng)功能評分最高,且誤差最小。詳見附表。

2 小鼠腦缺血再灌注不同時間的腦梗死體積

見圖 1及附表。假手術(shù)動物 T TC染色的腦切片上,兩側(cè)皮層呈均勻的橘紅色,未見梗死灶。暫時性 MCAO 30～ 60min僅形成很小的腦梗死灶,且梗死灶大小變異較大。而暫時性 MCAO 90min和 120min小鼠腦切面可見明顯的蒼白色梗死區(qū),與正常的腦組織(紅色)界線較明顯。但前者梗死灶周圍的半影區(qū)明顯多于后者,其梗死灶的大小又明顯小于前者,而且其恒定性明顯差于后者。統(tǒng)計結(jié)果表明,隨 MCAO時間的延長梗死灶大小逐漸增大,MCAO 120min再灌注 22h可引起該側(cè)大腦中動脈供血區(qū)域廣泛的梗死灶,累及同側(cè)外側(cè)面額葉、顳葉、頂葉及深部基底核團。而且,該模型中梗死灶大小適宜,穩(wěn)定性好,適合于腦缺血的對照研究。

附表 MCAO時間與術(shù)后 24h腦梗死灶體積及神經(jīng)功能評分的關(guān)系(n=10)

3 小鼠腦缺血再灌注損傷腦組織病理學(xué)觀察腦切片 HE染色,光鏡下正常腦組織可見大量神經(jīng)元,胞體呈多形性,胞質(zhì)透亮,細(xì)胞具有折光性,細(xì)胞核較大,圓形或卵圓形,核仁明顯,核膜清晰可見 (見圖2A)。于缺血半影區(qū)可見神經(jīng)元出現(xiàn)缺血性改變,胞漿空泡形成,核固縮、核周體消失等,但仍有部分正常的神經(jīng)元存在(見圖 2B)。腦梗死區(qū)見神經(jīng)元損害進一步加重,核固縮更為明顯,胞漿空泡進一步增大,胞質(zhì)嗜酸性增強的紅色細(xì)胞,細(xì)胞間隙加寬更為明顯及細(xì)胞核完全消失的鬼影細(xì)胞的神經(jīng)元壞死改變(見圖 2C)。

圖1 不同 M CAO時間小鼠腦梗死灶形成情況(T TC染色)

圖2 缺血再灌注損傷后小鼠腦標(biāo)本(HE染色×200)A為正常腦皮質(zhì);B為半影區(qū);C為梗死區(qū)

討 論

腦血管疾病是一組發(fā)病率、病死率都較高的疾病,為了攻克這一難題,人們從不同方面,使用了不同手段進行各種研究。在各項研究中,鼠實驗性急性腦缺血模型使用最為廣泛,愈來愈成為人們研究腦血管疾病的重要工具。大多數(shù)研究者選用了鼠作為動物模型,其原因:①鼠具有與人類極相似的腦血管結(jié)構(gòu);②種系內(nèi)純合性好;③有較多鼠缺血性的生理、病理和病生資料可供查詢;④動物成本低廉,易于管理,能做大量實驗[1,3]。

線栓法制作 MCAO模型的原理是結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈后,經(jīng)頸內(nèi)動脈插入單絲線段,送至大腦前動脈或者大腦中動脈近端。該線段直徑剛好與血管內(nèi)徑相吻合,并可借助有彈性的硅膠與血管壁緊密接觸,從而有效降低血流,同時阻斷大腦前動脈和頸內(nèi)動脈腦底段對大腦中動脈的血供,保證 MCAO模型的成功。此時,同側(cè)大腦前動脈可通過前交通動脈獲得對側(cè)大腦前動脈的血供,同側(cè)大腦后動脈理論上可通過后交通動脈獲得同側(cè)椎-基動脈的血供。這樣,僅有大腦中動脈供血區(qū)域發(fā)生局灶性腦梗死。當(dāng)拔除線段后,即可恢復(fù)上述被阻斷的血流,以完成再灌注過程[1,4,5]。

影響該模型的因素很多,包括種系、體重、性別、麻醉、線段制備等。其中線段的規(guī)格及制備過程是影響模型的關(guān)鍵因素,因為其他因素可人為控制。 1986年Koizumi[1]首先采用 4-0尼龍縫線從頸外動脈,頸內(nèi)、外動脈分叉處,經(jīng)頸內(nèi)動脈插到大腦前動脈,造成大腦中動脈發(fā)出處血供驟減甚至中斷來建立大腦中動脈缺血模型。可用尼龍釣魚線代替 4-0縫線,用動脈夾夾閉來代替結(jié)扎翼腭動脈。目前,有兩種經(jīng)典的方法:其一為 Longa法[6],將尼龍線插入端燙成圓球狀。其二是Koizumi法[1],將單絲線插入端涂上長 5mm、直徑 0.25mm的硅酮彈性小體。經(jīng) Laing[7]比較認(rèn)為 Koizumi法較 Longa法效果可靠。其優(yōu)點是無需開顱、缺血效果理想,能再灌注;缺點是結(jié)扎翼腭動脈要有一定的操作技巧。目前該法已逐漸取代開顱法而成為最流行的方法。

腦組織厚片 T TC染色是研究腦缺血梗死灶常用的染色方法。 T TC與完整的線粒體氧化酶系反應(yīng),誘發(fā)產(chǎn)生深紅色產(chǎn)物而使正常組織染色,缺血組織的線粒體損傷,不能誘導(dǎo)染色反應(yīng)而呈白色,容易鑒別。采用此方法我們比較 MCAO不同時間組間梗死體積,結(jié)果發(fā)現(xiàn)暫時性 MCAO 90min和 120min均可形成明顯的梗死灶,但前者梗死灶周圍的半影區(qū)明顯多于后者,而其梗死灶的大小又明顯小于前者,而且其恒定性明顯差于后者,因此,MCAO 120min再灌注 22h模型更適合于腦缺血的對照研究。而暫時性 MCAO 30～60min未能形成明顯的、恒定的梗死灶,這也說明短時間血管阻斷后恢復(fù)血流能挽救缺血腦組織,在此小鼠模型上,恢復(fù)血流,挽救瀕死神經(jīng)元的時限為 1～ 2 h。另外,通過神經(jīng)病學(xué)評分比較表明,右側(cè) MCAO 2h再灌注 22h,小鼠均可表現(xiàn)出明顯的癥狀,提尾懸空時頭向左歪,右前肢內(nèi)收、肩內(nèi)旋,右前肢肌張力降低,不能完全伸直,自主活動時向右旋轉(zhuǎn),行走時向右傾斜等。此結(jié)果與 TTC染色結(jié)果相一致。

缺血和缺血再灌注期間動物的體溫或腦溫的高低是影響缺血性腦損害程度的另一重要因素。實驗證明腦溫降低 3～ 4℃,即可明顯地減輕缺血性腦損害。反之,人為的增加腦的溫度將加重缺血性腦損害。在制作腦缺血模型時,動物的體溫 /腦溫將受諸多因素的影響而發(fā)生改變。例如麻醉可使代謝率減低、體溫下降;腦缺血本身可使腦組織代謝下降;手術(shù)時切開頭皮和打開顱骨,使腦的散熱加快等都可使腦溫降落,從而影響缺血損傷的程度[8,9]。我們在制作腦缺血模型時,術(shù)中配合加熱墊和紅外線燈泡照身來維護動物的體溫在37.5℃左右,術(shù)后小鼠置于 37℃恒溫箱內(nèi)直至完全清醒。

我們制作的小鼠插線 MCAO模型改良于Koizumi法制備的大鼠插線法局灶性腦缺血模型。插線時僅阻斷同側(cè)大腦中動脈的血流,拔線后可通過同側(cè)血流實現(xiàn)直接再灌流,與臨床病理狀態(tài)更接近。我們采用小鼠,因小鼠體重差異小,頸外動脈分叉處至頸內(nèi)動脈大腦中動脈起始部距離相差無幾,頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段及大腦前動脈近端的直徑相對一致。我們采用包被一層硅膠的 8-0單絲線段(直徑約 200 μ m),頭端圓滑,從頸外動脈分叉插入 11mm,既可送至大腦前動脈或者大腦中動脈近端。該線段直徑剛好與血管內(nèi)徑相吻合,并可借助有彈性的硅膠與血管壁緊密接觸,從而有效阻斷大腦中動脈血供,避免了因大鼠體重差異過大,插線深度、插線粗細(xì)不一,術(shù)后出現(xiàn)無效模型的缺點。我們的體會是插線法制作小鼠腦缺血 /再灌注模型,無須特殊設(shè)備,操作簡便,手術(shù)時間短,僅需 10min左右,無需開顱,創(chuàng)傷小,避免了開顱手術(shù)對腦組織的創(chuàng)傷和刺激及對顱內(nèi)壓的直接干擾和破壞作用,不影響缺血后腦水腫和梗死的病理變化的自然過程,更接近于臨床病理條件;術(shù)中不引起體溫、血壓、血氣的異常變化,優(yōu)于開顱結(jié)扎電凝大腦中動脈法;缺血的部位較恒定,避免了頸內(nèi)動脈注射血栓栓子閉塞大腦中動脈法所帶來的栓子隨機性,及栓子進入翼腭動脈造成顱外梗死的不足,且缺血及再灌注時間可準(zhǔn)確控制。另外,采用廉價,血管解剖近似于人的小鼠為實驗對象,比大鼠腦組織小、用藥量少,生化、組化檢測費用低,節(jié)約試驗耗材。為了系統(tǒng)的研究腦缺血 /再灌注的病理生理及觀察藥物的治療作用提供了一個較接近臨床的、重現(xiàn)性好、可控的腦缺血再灌注的模型。

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