江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(鎮(zhèn)江 212001) 鄭金旭 徐麗娜 范利娟

肺間質(zhì)纖維化是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的免疫炎癥相關(guān)疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前,細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在介導(dǎo)其早期肺泡炎及以后的纖維化過程中所起的作用日益受到重視。白細(xì)胞介素 31(Interleukin-31,IL-31)是 2004年新報(bào)道的細(xì)胞因子,屬于白細(xì)胞介素 6(Interleukin-6,IL-6)家族成員[1],通過誘導(dǎo)某些趨化因子表達(dá),發(fā)揮促臟器炎癥的作用。本研究通過動態(tài)觀察 IL-31 mRNA在肺纖維化發(fā)展各階段的變化規(guī)律,在國內(nèi)率先探討 IL-31在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用,進(jìn)一步完善細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在肺纖維化中的調(diào)控。

材料與方法

1 動物與試劑 實(shí)驗(yàn)用 6周齡雄性昆明種小鼠40只,體重 18～22g,由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為兩組,即:對照組:24只,僅給予生理鹽水;實(shí)驗(yàn)組 24只,給予博萊霉素溶液。博萊霉素(Bleomycin,BLM)15mg/支(1mg=1U),由日本化藥株式會社生產(chǎn)。DEPC購自 Sigma公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肺纖維化動物模型的建立 實(shí)驗(yàn)小鼠用4%水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉,仰臥于手術(shù)臺上,固定頭部及四肢,無菌條件下切開頸部皮膚,暴露氣管,經(jīng)氣管一次性注入配制好的博萊霉素溶液 (5 mg/kg),注射后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn) 2min,盡量使藥液在肺內(nèi)均勻分布。對照組在相同條件下經(jīng)氣管注入等體積生理鹽水。

2.2 標(biāo)本的處理 給藥后第 7、14、21、28天經(jīng)頸椎脫臼法每組分別處死 6只小鼠。無菌條件下分離出氣管和雙肺,右側(cè)肺組織用于檢測 IL-31mRNA,左側(cè)完整肺葉置于 4%多聚甲醛中固定,常規(guī)切片,HE染色。

2.3 檢測項(xiàng)目及方法

2.3.1 病理觀察 左肺石蠟切片行 HE染色,由病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

2.3.2 Real-time PCR測定肺組織中 IL-31mRNA的相對表達(dá) 取 40～ 50mg新鮮組織立刻加入 DEPC處理過的 1.5ml離心管中,加入 1ml Trizol,勻漿破碎組織,室溫靜止 5min,加入 200 μ l氯仿,劇烈震蕩 15s,12000G 4℃低溫離心 15min,小心吸取上清液 400 μl置于另一 1.5ml離心管中,加入 600 μ l異丙醇,輕輕顛倒混勻,室溫靜止 10min,12000G 4℃低溫離心 10min,去處上清液,加入 1ml DEPC處理過的水配置的 75%乙醇,7500G 4℃低溫離心 10min,去處上清液,室溫干燥 RNA約 5min后加入 20 μ l DEPC處理過的水溶解,樣品置于-70℃保存。此即小鼠總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒說明進(jìn)行操作。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行 PCR反應(yīng),檢測 IL-31mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系為 25 μ l,包括:10×定量 PCR緩沖液 2.5μ l、1 μ l cDNA 模板、1 μl dNTP(10 mmol/L)、2.5 μlMgCl2(25mmol/L)引物各 1 μl(5pmol/μ l)及 5U/μ l定量 Taq聚合酶 0.2 μl,Sybergreen I(20× )0.25 μ l,用 dd H2O補(bǔ)足至 25 μ l。 PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性 3min,使用 3步法,具體為 94℃45s,IL-31 60℃ /GAPDH 55℃ 45s,72℃ 60 s,35個循環(huán)擴(kuò)增。 取 10 μl PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳分析。

基因引物序列和片段長度如下:①IL-31基因引物:正義鏈為:5'-TTCCACAC AGGAACAACGAA-3'(201bp),反義鏈為:5'-TGAT TCGTCTGCTGACA TCC-3';②GAPDH基因引物:正義鏈為:5'-GCTGGT CATCAACGGGAAA(105bp),反義鏈為:5'-ACGCC AGT AGACTCCACGACA-3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS13.0軟件處理系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,多組均數(shù)間采用單因素方差分析,兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn),以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 肺組織病理學(xué)變化 見圖 1～ 5。實(shí)驗(yàn)組動物第 7天時(shí)肺泡間隔增厚,肺內(nèi)可見廣泛炎性細(xì)胞浸潤,并可見成纖維細(xì)胞增生,其中可見少量纖維組織。第14～ 28天肺泡炎逐漸減輕,纖維化病變逐漸加重,第28天時(shí)肺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見大片纖維結(jié)締組織沉積,肺泡結(jié)構(gòu)多數(shù)破壞。而對照組肺內(nèi)結(jié)構(gòu)正常。

圖1 對照組小鼠肺組織鏡下變化(HE染色 10×10)

圖2 BLM干預(yù)后第 7天小鼠肺組織鏡下變化(HE染色 10× 10)

圖3 BLM干預(yù)后第 14天小鼠肺組織鏡下變化(HE染色 10× 10)

圖4 BLM干預(yù)后第 21天小鼠肺組織鏡下變化(HE染色 10×10)

圖5 BLM干預(yù)后第 28天小鼠肺組織鏡下變化(HE染色 10× 10)

附表 兩組肺組織中 IL-31m RNA表達(dá)情況比較±s,IL-31/GAPDH)

附表 兩組肺組織中 IL-31m RNA表達(dá)情況比較±s,IL-31/GAPDH)

注:與對照組比較,# P＜0.05,* P＜0.01

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圖6 兩組 IL-31m RNA表達(dá)情況

圖7 實(shí)驗(yàn)組 IL-31m RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖8 實(shí)驗(yàn)組 GAPDHm RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2 RT-PCR法測定肺組織中 IL-31mRNA含量的變化 見附表及圖 6～ 8。實(shí)驗(yàn)組中 IL-31m RNA表達(dá)水平在第 7、14、21天高于對照組(P ＜0.05)。

討 論

肺間質(zhì)纖維化是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的免疫炎癥相關(guān)疾病[2],臨床上各種類型肺纖維化皆以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集為特征[3]。多種細(xì)胞因子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)在肺局部損傷、炎癥反應(yīng)以及隨后的組織修復(fù)和纖維化過程中起著重要作用[4]。

IL-31是 2004年新報(bào)道的細(xì)胞因子,在生理狀態(tài)下 IL-31基因表達(dá)水平較低,炎性反應(yīng)時(shí)主要由活化的 T細(xì)胞產(chǎn)生。 IL-31R α在人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞微量表達(dá),支氣管上皮細(xì)胞有輕度表達(dá)[5]。 IL-31在支氣管哮喘等疾病中發(fā)揮作用,同時(shí)還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)趨化因子等作用[6]。IL-31屬 IL-6家族成員,IL-6可誘導(dǎo)肺內(nèi)成纖維細(xì)胞合成釋放 C反應(yīng)蛋白等急性期蛋白,促進(jìn)非特異性的炎癥反應(yīng)。肺泡巨噬細(xì)胞被激活可通過分泌 IL-6而參與早期肺泡炎和后期肺纖維化的形成。IL-6可獨(dú)自或與 TNF-α聯(lián)合作用促進(jìn)纖維化的形成[7]。

在參與肺纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中,T GF-β是目前研究較為明確的細(xì)胞因子,其促進(jìn)纖維化生成的分子機(jī)制已基本肯定。有報(bào)道,在原代培養(yǎng)的肺泡上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞中均有 IL-31R α mRNA表達(dá),用 T GF-β刺激后檢測到在原代培養(yǎng)的肺泡上皮細(xì)胞中 IL-31R α mRNA的表達(dá)增多。研究表明,IL-31R α的表達(dá)增多與 IL-31的增多呈關(guān)聯(lián)性[8]。推測 TGF-β除本身具有促纖維化功能之外,還可能刺激 IL-31的表達(dá),二者共同參與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,正常對照組小鼠肺內(nèi)僅有少量 IL-31mRNA的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)組小鼠的病變早期(第 7天),肺組織中的 IL-31m RNA表達(dá)水平即增高,且隨天數(shù)增加,含量呈增高趨勢,到第 21天時(shí)達(dá)到高峰。由此可見,IL-31參與肺纖維化形成的各個階段,但主要在肺纖維化中后期發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明,IL-31在肺纖維化各階段表達(dá)明顯高于正常對照組,提示在肺纖維化過程中起重要作用,是參與肺纖維化形成的新的細(xì)胞因子。 IL-31在肺纖維化中發(fā)揮的作用以及與 TGF-β等其它細(xì)胞因子之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步探討。

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