石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子 832000)

王江平 丁國(guó)富 王勤章※ 李令勛 倪 釗 李應(yīng)龍 王新敏 謝順明 錢 彪 王文曉

近年來(lái),在膀胱中發(fā)現(xiàn)了在形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)上與胃腸 Cajal細(xì)胞相似的細(xì)胞-Cajal樣細(xì)胞。 Cajal樣細(xì)胞是否象胃腸 Cajal細(xì)胞一樣在逼尿肌收縮活動(dòng)中充當(dāng)起搏細(xì)胞的角色,并且參與神經(jīng)肌肉信號(hào)的傳導(dǎo)、調(diào)節(jié),目前尚不清楚。本研究擬通過在體內(nèi)阻斷 c-kit信號(hào)途徑造成豚鼠膀胱 Cajal樣細(xì)胞缺失后,觀察其對(duì)逼尿肌自主收縮活動(dòng)的影響,從而探討豚鼠膀胱 Cajal樣細(xì)胞在膀胱逼尿肌自發(fā)收縮活動(dòng)中的作用。

材料與方法

1 動(dòng)物模型的建立與分組 選取新生豚鼠 20只,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組 10只。實(shí)驗(yàn)組將出生 24h內(nèi)的豚鼠腹腔內(nèi)隔天注射 c-kit抗體(ACK2)100 μ g,共 5次,對(duì)照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水,于第 10天手術(shù)取膀胱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察 手術(shù)取出膀胱,切取膀胱全層組織,OCT包埋,-80℃預(yù)冷 30 min,用恒冷冰凍切片機(jī)切 20 μ m厚度切片,粘于多聚賴氨酸處理的載玻片上,涼干后,丙酮固定10min。

每只豚鼠取一張切片,冰凍切片加 1%胎牛血清室溫孵育 30min,再加入一抗 (小鼠抗大鼠 CD117,1∶100,500 μ g/ml,Millipore公司)室溫下濕盒內(nèi)孵育1h,取出切片置于 4℃孵育過夜后再加入二抗(FITC標(biāo)記山羊抗大鼠 1∶25),置于 37℃濕盒內(nèi)避光孵育60min。以上各步間均以 0.01mol/L PBS漂洗 5min×2次。拭凈后甘油封片,每張切片在 LSCM(ZEISS LSM 510 MET A)下隨機(jī)取 5個(gè)視野,測(cè)定 Cajal樣細(xì)胞胞體和和突起所占面積的百分比,取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

觀察 c-kit陽(yáng)性細(xì)胞 LSCM技術(shù)參數(shù):針孔1000 μ m,X軸點(diǎn)掃描點(diǎn)數(shù) 250,Y軸掃描點(diǎn)數(shù) 250,掃描步徑 1 μm,鏡掃描速度 1mm/s,兩次平均,物鏡 40倍,長(zhǎng)通 505激光透過,檢測(cè)器波長(zhǎng) 488nm,靈敏度19.8%。

3 體外肌條實(shí)驗(yàn) 擊打豚鼠頭部將其致死,取下腹正中切口,游離膀胱并自膀胱頸部離斷,置于 kreb液中漂洗干凈,并持續(xù)供給 97%氧氣、3%二氧化碳混合氣體,剪去黏膜,自膀胱取 6mm×3mm肌條。兩端以5--0絲線固定,肌條與張力換能器相連,調(diào)節(jié)微螺旋給張力換能器 1g負(fù)荷,溫育 1h。張力換能器信號(hào)輸入四通道生理記錄儀,記錄逼尿肌收縮的頻率和幅度變化曲線 15min。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組所有數(shù)據(jù)采用 x-±s表示,運(yùn)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),兩樣本率行卡方檢檢,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 豚鼠逼尿肌 Cajal樣細(xì)胞形態(tài)與分布觀察 兩組可見雙極 Cajal樣細(xì)胞形態(tài)基本一致,呈梭形雙極細(xì)胞,表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個(gè)長(zhǎng)突起和許多短突起,胞膜著色而胞漿和胞核不被染色,主要分布于逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中。對(duì)照組:①Cajal樣細(xì)胞數(shù)量多(見圖 1),c-kit陽(yáng)性細(xì)胞率(%)為 2.37±0.42%;②許多相鄰兩個(gè) Cajal樣細(xì)胞緊密連結(jié),形成 Cajal樣細(xì)胞二聚體,c-kit陽(yáng)性細(xì)胞二聚體(%)為 0.62±0.11%。 實(shí)驗(yàn)組:①Cajal樣細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖 2),c-kit陽(yáng)性細(xì)胞率(%)為 0.47±0.17(P＜0.01),3個(gè)實(shí)驗(yàn)組豚鼠膀胱標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn) Cajal樣細(xì)胞;②視野下未見 Cajal樣細(xì)胞二聚體(P＜0.01)。

2 離體豚鼠逼尿肌自主收縮活動(dòng) 將對(duì)照組逼尿肌肌條溫育 1h后出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)收縮活動(dòng),收縮幅度為 925.33± 68.91mm,收縮頻率為 2.58±0.17次 /min。實(shí)驗(yàn)組逼尿肌肌條收縮幅度明顯下降(197.47±39.20mm),逼尿肌肌條收縮頻率也明顯下降(1.11±0.17次 /min),兩組相比均有極顯著性差異 (P＜0.01)。

圖1 對(duì)照組 Cajal樣細(xì)胞分布

圖2 實(shí)驗(yàn)組 Cajal樣細(xì)胞分布

討 論

體外肌條實(shí)驗(yàn)已證實(shí)逼尿肌在一定的張力下可以出現(xiàn)自發(fā)性收縮,表明逼尿肌具有一定的自發(fā)興奮收縮性,但這種自發(fā)興奮收縮性產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確。近年來(lái),在膀胱中發(fā)現(xiàn)了在形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)上與胃腸Cajal細(xì)胞相似的細(xì)胞-Cajal樣細(xì)胞,其細(xì)胞表面表達(dá)的 c-kit受體被用來(lái)作為該細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,在逼尿肌不穩(wěn)定患者的膀胱中發(fā)現(xiàn) Cajal樣細(xì)胞的數(shù)量較正常膀胱明顯增多,引發(fā)人們對(duì)該細(xì)胞在膀胱自發(fā)興奮收縮中所扮演的角色產(chǎn)生興趣。在胃腸中,Cajal細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)扮演起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號(hào)的功能。那么,膀胱 Cajal樣細(xì)胞是否像胃腸 Cajal細(xì)胞在膀胱中扮演的角色一樣,這值得進(jìn)一步探討。

在胃腸 Cajal細(xì)胞能特異性表達(dá) c-kit受體,并且c-kit信號(hào)途徑對(duì)于 Cajal細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育具有重要作用,持續(xù)的 c-kit信號(hào)刺激是小鼠胃腸 Cajal細(xì)胞形成和維持所必須的[1]。 ACK2為 c-kit的單克隆中和抗體,其具有特異地拮抗 c-kit的作用。 Torihashi等[2]給新出生的小鼠腹腔注射 ACK2,發(fā)出阻滯 c-kit信號(hào)后,Cajal細(xì)胞失去正常表型而呈現(xiàn)部分類似平滑肌細(xì)胞樣表型,并導(dǎo)致小鼠腸管正常位相收縮紊亂、慢波活動(dòng)消失。本實(shí)驗(yàn)參照 Torihashi等[2]的方法,制作豚鼠模型,免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常豚鼠 10d幼鼠膀胱中可見 Cajal樣細(xì)胞并呈網(wǎng)絡(luò)狀分布,許多相鄰兩個(gè) Cajal樣細(xì)胞緊密連結(jié),形成 Cajal樣細(xì)胞二聚體。經(jīng) ACK2處理的實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn) Cajal樣細(xì)胞數(shù)量明顯減少甚至消失,零散分布,視野下未見Cajal樣細(xì)胞二聚體。進(jìn)一步體外逼尿肌肌條實(shí)驗(yàn)證明Cajal樣細(xì)胞缺失的實(shí)驗(yàn)組逼尿肌肌條收縮頻率及幅度明顯下降,逼尿肌自主興奮收縮性不僅與 Cajal樣細(xì)胞數(shù)量,也可能和其分布、形態(tài)有關(guān),細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和分布的異?？赡苡绊懥俗灾髋d奮信號(hào)的產(chǎn)生、傳導(dǎo)及調(diào)節(jié),進(jìn)而表現(xiàn)為逼尿肌肌條自主收縮活動(dòng)性的異常。反證了膀胱 Cajal樣細(xì)胞在膀胱中可能扮演起搏細(xì)胞的角色,并參與神經(jīng)、肌肉興奮信號(hào)的傳導(dǎo)與調(diào)節(jié),這為進(jìn)一步深入研究膀胱 Cajal樣細(xì)胞的功能提供了理論依據(jù),也為臨床治療膀胱疾病提供了新的切入點(diǎn)。

[1] Ward SM,Sanders,KM.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedsideI. Functional development and plasticity of interstitial cellsofCajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(3):602-611.

[2] Torihashi S,Nishi K,Tokutomi Y,et al.Blockade of kit signaling induces transdifferentiation of interstitial cells of Cajal to a smooth muscle phenotype.gastroenterology,1999,117(1):140-148.