曾永群,陳秋月,李凡彩

卵巢癌是嚴重危害婦女健康的 4大惡性腫瘤之一。由于未能對疾病做出早期診斷以及尚無有效的治療方法,以致 80%的卵巢癌患者到了晚期才被發(fā)現(xiàn),因而 5年生存率不足 20%。近年來,有關(guān)卵巢癌早期血清學免疫診斷方法的研究對各種腫瘤標志物的診斷價值多有評價。本研究采用組織微陣列 (組織芯片)技術(shù)直接檢測卵巢良惡性病變組織標本中 CA-125抗原 (CA125)、腫瘤抑制蛋白質(zhì) p53(P53)、Ki-67抗原(Ki-67)及抑癌基因 p27蛋白 (P27)的表達,并且使用多變量二元回歸和受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve,ROC曲線)對檢測結(jié)果進行分析,以評價這些免疫指標作為病理輔助診斷指標的意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇廣西桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 2003—2008年經(jīng)婦科臨床和病理確診的卵巢良惡性腫瘤患者,年齡為 18～71歲。所選病例由美國泛普生物技術(shù)有限公司 (PANTOMICS Inc,桂林)制作成組織芯片,再用組織芯片進行免疫組化染色。組織芯片顯示直徑 1.5 mm的圓形芯粒陣列,無皺褶,鏡下可見細胞結(jié)構(gòu)清晰,著色定位明確。入選組織芯片批號為OVC1021,其中含有 96例卵巢癌組織芯粒;另有批號為OVD361組織芯片,含有 22例卵巢良性瘤芯粒。在同一組織芯片布陣正常卵巢組織作為質(zhì)量控制參照。

1.2 方法 采用快速免疫組化染色方法對組織芯片進行染色。按常規(guī)設(shè)陽性對照,使用 PBS代替抗體做陰性對照。在操作中,一種抗體使用一張芯片進行免疫組化染色,同時用另一張芯片進行常規(guī) HE染色做對照。CA125、P53、Ki-67、P27免疫組化試劑由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司配套提供。

1.3 陽性表達的判定標準 陽性表達細胞在細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)有深棕黃色細小顆粒,著色程度明顯高于背景色,且有明確定位。而陰性表達細胞未見上述染色標記。各抗體陽性標記定位有所不同,CA125在細胞質(zhì),P53、P27、Ki-67則在細胞核內(nèi)。根據(jù)細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)染色顆粒分布,將表達程度分為4級:1%以下 (陰性),1%～10%以下 (弱陽性),10%～50%(中度陽性), ＞50%(強陽性)。

1.4 統(tǒng)計學方法 本研究觀察的病例以病理組織學診斷為金標準。狀態(tài)變量為 2個值 (0,1),其中卵巢癌為 1,卵巢良性瘤為 0。使用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對免疫指標在卵巢癌和卵巢良性瘤中表達的差異進行顯著性檢驗,對于差異有統(tǒng)計學意義的指標進行 2個或3個指標組合,分別做二元邏輯回歸分析及 ROC曲線分析,以比較不同聯(lián)合檢測形式的檢測效能[1]。

2 結(jié)果

2.1 CA125、P53、Ki-67和 P27在卵巢癌和卵巢良性瘤中表達水平的比較 卵巢癌組織中各個指標 (CA125、P53、Ki-67、P27)的陽性表達率與卵巢良性瘤比較,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 1)。

表 1 CA 125、P53、Ki-67、P27在卵巢癌與卵巢良性瘤組織中的陽性表達率比較 〔n(%)〕Tab le 1 The comparison of CA 125,P53,Ki-67and P27 expression between ovarian cancer and innocent tumor

2.2 免疫檢測指標 ROC曲線分析 對 CA125、P53、Ki-67、P27進一步做 ROC曲線分析。以敏感度 (真陽性率)為縱坐標、1-特異度 (假陽性率)為橫坐標繪制 ROC曲線。ROC曲線下面積 (AUC)范圍為 0～1,以 AUC=0.5作為無效假設(shè) (診斷點)。AUC越大,診斷價值就越高;反之,則越低。

2.2.1 CA125、P53、Ki-67、P27單項檢測的 ROC曲線分析CA125、P53、Ki-67、P27的 AUC以 P53最高 (0.730,P=0.001);其次為 CA125(0.657,P=0.022);然后是 Ki-67(0.617,P=0.087)和 P27(0.371,P=0.060)。提示P53檢測的準確性比其他指標相對較高;其次為 CA125。由于Ki-67和 P27的 AUC與參考線下面積比較無顯著性差異,故認為 Ki-67和 P27單個檢測未能達到診斷所要求的準確性水平 (見圖 1和表 2)。

2.2.2 各免疫檢測指標聯(lián)合檢測的效能比較 對 CA125+P53、CA125+P53+Ki-67、CA125+P53+Ki-67+P27聯(lián)合檢測分別進行二元邏輯回歸分析和 ROC曲線分析,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的 AUC分別提高到 0.773(P=0.000)、0.804(P=0.000)和 0.824(P=0.000)。可見,不同形式的聯(lián)合檢測均能不同程度地提高 AUC,即提高檢測的敏感度 (見圖 2～4,見表 2)。

圖 1 CA 125、P53、Ki-67、P27單項檢測的 ROC曲線圖Figure 1 ROC curve of CA125,P53,Ki-67 and P27

圖 2 CA 125+P53聯(lián)合檢測的 ROC曲線分析圖Figure 2 ROC curve of combined CA125 with P53

圖 3 CA125+P53+Ki-67聯(lián)合檢測的 ROC曲線分析圖Figu re 3 ROC curve of combined CA125 with P53 and Ki-67

圖 4 CA 125+P53+Ki-67+P27聯(lián)合檢測 ROC曲線分析圖Figure 4 ROC curve of combined CA125with P53,Ki-67 and P27

表 2 單個或聯(lián)合免疫組化指標 ROC曲線分析結(jié)果Tab le 2 The results of ROC curve analysis for single or combined several immunohistochem ical indexes

3 討論

根據(jù) WHO分類,卵巢上皮性腫瘤包括:良性上皮性腫瘤(良性瘤),惡性上皮性腫瘤 (癌),界于良性與惡性之間的上皮腫瘤 (交界瘤)。長期以來對于卵巢交界瘤,無論是病理診斷、生物學行為和治療方法上始終存在較多的爭論。特別是當病變不典型時,組織學診斷標準較難把握,鑒別診斷難度較大。尤其是對年輕、未婚、未育的患者,癌和交界瘤的鑒別診斷和治療存在較大的風險。為提高卵巢癌的診治水平,臨床上需要既具有較高靈敏度又有較好特異性的卵巢癌標志物。本研究使用組織芯片技術(shù)對 CA125、P53、Ki-67、P27作為病理診斷輔助指標的應用意義進行逐個評價。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:CA125、P53、Ki-67在卵巢癌組織中的表達高于卵巢良性瘤(P＜0.05);而 P27在卵巢癌組織中的表達則低于卵巢良性瘤(P＜0.05)。單項指標的 ROC曲線分析分別顯示,P53的AUC達到 0.730(P＜0.01),CA125為 0.657(P＜0.05),Ki-67為 0.617(P＞0.05),P27為 0.371(P＞0.05)。AUC作為反映診斷準確性的尺度,取值范圍在 0.5～1.0。通常,AUC在 0.5～0.7時,表示診斷準確性較低;＞0.7～0.9時,診斷準確性為中等;＞0.9時,診斷準確性較高[2]。由此判斷,P53診斷準確性在中等范圍,CA125屬于低準確性指標,Ki-67和 P27均未能達到有效的診斷準確性。根據(jù)統(tǒng)計分析判斷,P53作為卵巢癌病理診斷輔助指標具有一定的意義;而CA125、Ki-67、P27單個檢測對于卵巢癌病理診斷無明確的應用價值。

有研究報道,準確性較低的變量使用多變量聯(lián)合檢測可進一步提高檢測效能[3-5]。本研究采用二元邏輯回歸分析及 ROC曲線分析方法對 CA125、P53、Ki-67、P27進行評價,發(fā)現(xiàn)CA125+P53、 CA125+P53+Ki-67以及 CA125+P53+Ki-67+P27聯(lián)合檢測的 AUC均得到提高,分別達到 0.773(P＜0.01)、0804(P＜0.01)和 0.824(P＜0.01)。由此可見,在臨床病理診斷中,采用聯(lián)合檢測不僅可以在一定程度上提高病理醫(yī)師對卵巢癌診斷的判斷力,特別是對交界性腫瘤惡性傾向的判斷有參考價值,可用于病理輔助診斷。但在實際應用中,建議權(quán)衡診斷效能與資源消耗合理地選擇聯(lián)合檢測的方式。

迄今,對于卵巢癌早期診斷而言,沒有一種理想的腫瘤標志物可以達到完全滿意的靈敏度和特異度,甚至在疾病晚期,目前也沒有任何能夠準確預測疾病發(fā)展過程的生物標記物[6]。腫瘤免疫標記物的表達程度取決于體內(nèi)抗原產(chǎn)生的程度,而影響抗原產(chǎn)生的因素不是單一的。惡性腫瘤基因表達的多樣性導致腫瘤標志物的多樣性;同一種基因也可在不同的惡性腫瘤中表達。因此,使用單一標志物的診斷準確性往往較低,多個標志物聯(lián)合檢測則可有效提高診斷的準確性。盡管如此,卵巢癌的診斷除了應用病理組織學以及合理選擇輔助免疫組化指標之外,還應綜合患者家族史、臨床表現(xiàn)、超聲檢查等手段做出準確診斷。

1 劉潤幸.使用 SPSS作多變量觀察值的 ROC曲線分析 [J].中國公共衛(wèi)生,2003,19(9):1151-1152.

2 陳衛(wèi)中,倪宗瓚,潘曉平,等.用 ROC曲線確定最佳臨界點和可疑值范圍 [J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2005,32(7):729-731.

3 邢桂芝,周秀艷.應用 ROC曲線評價血清 CA 125、CA 199和 CEA對卵巢癌的診斷價值 [J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2009,36(18):3592-3594.

4 劉預,林丁,周琦,等.多腫瘤標志物蛋白芯片在卵巢癌診斷中的應用 [J].臨床腫瘤學雜志,2007,12(3):195-197.

5 羅賢波.CA125、CA 19-9、CEA聯(lián)合檢測在卵巢癌診斷中的價值[J].中國醫(yī)療前沿,2009,4(6):77-78.

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