施 華,宋旭東,張曉霞,張志勇,朱海燕

對(duì)乳腺癌的治療研究發(fā)現(xiàn),對(duì)同一臨床分期及病理類型的乳腺癌,采用同一治療方案的療效可出現(xiàn)明顯不同。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究證實(shí)乳腺癌預(yù)后與許多分子標(biāo)志物密切相關(guān)。2000年,Perou等[1]在總結(jié)分析前人發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,使用 cDNA微陣列研究發(fā)現(xiàn)了乳腺癌生物學(xué)上的差異,并提出乳腺癌的分子分型。本研究通過免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)定量 PCR法探討胰腺同源合 -1(PDX-1)與乳腺癌分子分型的關(guān)系,為臨床制定乳腺癌的個(gè)體化治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集唐山市工人醫(yī)院2005年 1月—2008年 5月術(shù)中切取的石蠟和新鮮標(biāo)本各 200例?；颊咝g(shù)前未經(jīng)任何治療,標(biāo)本經(jīng)術(shù)中快速病理診斷均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。

1.2 主要試劑 二抗 PDX-1、雌激素受體 (ER)、孕激素受體 (PR)、第二號(hào)人類表皮生長(zhǎng)因子受體 (Her-2)、細(xì)胞角蛋白 5＆6(CK5/6)和上皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)等免疫組化試劑購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。SYBR Green PCRⅠ、Rnase酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、Olig(dT)15引物均購(gòu)自美國(guó)Promega公司,dNTP購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,PDX-1引物(上游 :5′-CTTG GGTATGGATCTGTG G-3′, 下游:5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′)和 β -actin引物 (上游 5′-CCATCATGAAGTGTGACGTGG-3′, 下游:5′-GTCCGCCTAGAAG CATTTGCG-3′)購(gòu)自北京奧科公司。

1.3 主要方法 免疫組化采用 EnVision法,詳細(xì)操作過程參照說明書。用已知陽(yáng)性乳腺癌切片做陽(yáng)性對(duì)照,以 PBS代替一抗做空白對(duì)照[2]。隨機(jī)觀察計(jì)數(shù) 10個(gè)高倍視野的 PDX-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù),平均每高倍鏡視野的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥15%即判斷為陽(yáng)性。其中 Her-2以≥30%的細(xì)胞膜顯色為陽(yáng)性。

提取組織總 RNA按照 Total RNA isolation system說明書操作。cDNA合成的反應(yīng)體系為:5×Revesre trnascripaste 5.0 μl,dNTP 2.0 μl,RNasin 0.5 μl、MMLV RTase0.5μl(總體積 20μl),37℃60 m in、95℃ 5 min得到 cDNA溶液。PCR反應(yīng)體系為:單鏈 cDNA 1μl、SYBR Green PCR I 1 μl、 10 ×PCR buffer 5μl、 PCR上游引物 1.5μl、 PCR下游引物 1.5μl、 MgCl27μl、 Taq DNA Polymerase0.5 μl、 dNTP 1 μl、 DEPC處理過的水 33μl。溫度條件:94℃10min、 94℃30 s、57℃ 30 s、 72℃ 30 s共 45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品中 PDX-1 mRNA值以相對(duì)量表示 (N=PDX-1 Ct值 /β-actin Ct值)。

1.4 分型標(biāo)準(zhǔn) 乳腺癌分子亞型參照Nielsen分型標(biāo)準(zhǔn)[3],以免疫組化結(jié)果進(jìn)行分型:(1)腺腔 A型:ER(+)/PR(+)、Her-2(-);(2)腺腔 B型:ER(+)/PR(+)、Her-2(+);(3)Her-2過表達(dá)型:ER(-)/PR(-)、Her-2(+);(4)基底細(xì)胞樣型:ER、PR和 Her-2均為 (-),CK5/6和 (或)EGFR(+);(5)未分類型:ER、PR、Her-2、CK5/6、EGFR均(-)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行 χ2檢驗(yàn)和方差分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 PDX-1蛋白和 mRNA在乳腺癌管腔 A型和管腔 B型中的表達(dá)顯著低于 Her-2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型和未分類型 (P＜0.05,見表 1)。

表 1 PDX-1蛋白和 PDX-1mRNA在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)Tab le 1 Expression of PDX-1 protein and PDX-1 mRNA in molecular subtype of breast cancer

3 討論

隨著對(duì)乳腺癌的深入研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌是一類在分子水平上具有高度異質(zhì)性的疾病,傳統(tǒng)的病理形態(tài)學(xué)診斷及分期已不適應(yīng)腫瘤學(xué)研究的發(fā)展需求,從分子水平對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制及生物學(xué)行為進(jìn)行研究已成為當(dāng)前的研究方向。以腫瘤分子表達(dá)差異為基礎(chǔ)的乳腺癌分子分型的提出將對(duì)于解決腫瘤的異質(zhì)性、分期的合理性、預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性及乳腺癌的個(gè)體化治療提供重要的依據(jù)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇在乳腺癌分子分型的基礎(chǔ)上分析PDX-1的表達(dá)情況。

PDX-1是胰腺胚胎發(fā)育中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,具有調(diào)節(jié)胚胎期胰島細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和成熟及 β細(xì)胞的分泌功能[3]。Tirone等[4]發(fā)現(xiàn)用 RIP(rat insulin promoter)/tk(thymidine kinase)轉(zhuǎn)染鼠胰島瘤 NIT-1細(xì)胞,可預(yù)防低血糖癥和腫瘤生長(zhǎng)。此后,有研究進(jìn)一步證實(shí)PDX-1不僅與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[5-6],還可用于胰腺、胃腸及肺臟腺癌的鑒別診斷。我們前期的研究亦發(fā)現(xiàn) PDX-1在乳腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織和乳腺良性病變組織[7],提示 PDX-1參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Levy等[8]對(duì)體外乳腺癌AU565細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn),PDX-1 mRNA在乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)并激活 RIP,外源性 PDX-1能提高 LacZ在 AU565中的表達(dá)。因此他們認(rèn)為 RIP-TK/GCV治療對(duì)乳腺癌細(xì)胞株有細(xì)胞毒性,外源性PDX-1提高細(xì)胞毒性。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了利用腫瘤細(xì)胞某些特異抗原轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)高的特點(diǎn),啟動(dòng)藥物前體轉(zhuǎn)化酶激活,達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的途徑是可行的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 PDX-1蛋白和mRNA在乳腺癌管腔型中的表達(dá)顯著低于其他分子亞型,臨床檢測(cè) PDX-1蛋白或mRNA的表達(dá),有助于乳腺癌的臨床病理分型。此外,乳腺癌治療方案的選擇主要取決于癌細(xì)胞 ER、PR及 Her-2的表達(dá)。其中管腔型者為雌激素和 (或)孕激素受體表達(dá)陽(yáng)性,適合激素內(nèi)分泌治療。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們推測(cè)對(duì)于 ER陰性的患者在不適宜進(jìn)行內(nèi)分泌治療的情況下,可以進(jìn)行針對(duì) PDX-1的基因治療。PDX-1在乳腺癌中的臨床意義與對(duì)腸癌的研究結(jié)果[9]相似,有望成為評(píng)判乳腺癌預(yù)后、分子分型和基因治療的參考指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì) PDX-1與乳腺癌分子亞型之間的關(guān)系進(jìn)行研究分析,未能全面反映 PDX-1對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為的影響,還有待更深層次的探討。

1 Perou CM,Sorlie T,Eisen MB,et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature,2000,406(6797):747-752.

2 Nielsen TO,Hsu FD,Jensen K,et al.Immunohistochem ica and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(16):5367-5374.

3 Gannon M,Ables ET,Crawford L,et al.pdx-1 function is specifically required in embryonicβcells to generate appropriate numbers of endocrine cell types and maintain glucose homeostasis[J].Dev Biol,2008,314(2):406-417.

4 Tirone TA,Fagan SP,Templeton NS,et al.Insulinoma-induced hypoglycemic death in m ice is prevented with beta cell-specific gene therapy[J].Ann Surg,2001,233(5):603-611.

5 Quint K,Stintzing S,Alinger B,et al.The expression pattern of PDX-1,SHH,Patched and G li-1 is associated with pathological and c linical features in human pancreatic cancer[J].Pancreatology,2009,9(1-2):116-126.

6 Srivastava A,Hornick JL.Immunohistochemical staining for CDX-2,PDX-1,NESP-55,and TTF-1 can help distinguish gastrointestinal carcinoid tumors from pancreatic endocrine and pulmonary carcinoid tumors[J].Am J Surg Pathol,2009,33(4):626-632.

7 施華,宋旭東,張曉霞,等 .乳腺癌組織中 PDX-1蛋白及mRNA的表達(dá)變化及意義 [J].山東醫(yī)藥,2009,49(42):102.

8 Levy S,Zhou B,Ballian N,et al.Cytotoxic gene therapy for human breast cancer in vitro[J].J Surg Res,2006,136(1):154-160.

9 Ballian N,Liu SH,Brunicardi FC.Transcription factor PDX-1 in human colorectal adenocarcinoma:a potential tumormarker?[J].World J Gastroenterol,2008,14(38):5823-5826.