劉靜波 陳代文* 余 冰

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,雅安 625014;2.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室,雅安 625014）

骨骼代謝主要包括破骨細(xì)胞對已經(jīng)存在的骨骼進(jìn)行的骨吸收和成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成,破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞這2種細(xì)胞系功能的穩(wěn)定對維護(hù)骨骼的健康至關(guān)重要。人從青春期至中老年期,由上述2種細(xì)胞系維持的骨骼代謝總是維持在一個平衡狀態(tài),但是中年婦女絕經(jīng)后這種平衡狀態(tài)被打破,從而出現(xiàn)骨骼代謝紊亂。這主要是因為性腺功能衰退使得破骨細(xì)胞上的雌激素α受體介導(dǎo)的信號途徑減弱而導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨吸收增加[1],進(jìn)而使骨量減少,甚至出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥[2]。骨骼代謝疾病已經(jīng)成為威脅當(dāng)今世界各國中老年人健康的主要代謝疾病之一,因此,通過一定的手段維持骨形成與骨吸收之間的平衡對于減少骨骼代謝疾病的發(fā)生具有重要的意義。

臨床研究已經(jīng)揭示了一個不爭的事實,即中老年婦女性腺功能衰退之后,通常伴隨著脂肪沉積增加和骨質(zhì)疏松,這暗示哺乳動物的繁殖系統(tǒng)、脂肪沉積和骨骼代謝可能通過相同的激素調(diào)控[3]。自被發(fā)現(xiàn)以來,瘦素（leptin）基因及其受體一直被認(rèn)為是調(diào)控能量代謝和繁殖的重要信號分子[4-5],而且流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)人進(jìn)入中老年后適度的肥胖能夠降低骨折的發(fā)生率,提示leptin可能參與調(diào)節(jié)骨骼代謝[6]。近年以基因敲除小鼠為動物模型的研究發(fā)現(xiàn),leptin與其受體結(jié)合之后啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對骨骼代謝的調(diào)控非常重要[3,7]。因此,本文主要就leptin調(diào)控骨吸收和骨形成的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑做一簡要綜述,為增進(jìn)人類骨骼健康提供重要參考。

1 leptin基因（ob/ob）及其受體基因（db/db）敲除對骨骼代謝的影響

為了研究leptin對骨骼代謝的影響,Ducy等[7]通過基因手段敲除lep tin基因（ob/ob）和lep tin受體基因（db/db）,發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠和db/db小鼠的骨量和骨密度均顯著增加,且除了肥胖之外,ob/ob小鼠和db/db小鼠還出現(xiàn)了性腺功能衰退以及皮質(zhì)酮增多癥。前人的研究表明,性腺功能衰退導(dǎo)致的雌激素減少[1,8]和皮質(zhì)醇增多癥[9]均能夠誘導(dǎo)骨吸收增加,導(dǎo)致骨量減少,但是Ducy等[7]的研究卻發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠和db/db小鼠骨量均顯著增加,說明了leptin對骨量的影響甚至超出了雌激素和皮質(zhì)酮的作用。

骨骼代謝是由骨形成和骨吸收來維持的,因此leptin信號缺失小鼠的骨形成和骨吸收勢必受到影響,進(jìn)而導(dǎo)致骨量增加。鈣黃綠素（calcein）是反映骨形成的重要指標(biāo),研究發(fā)現(xiàn)3月齡和6月齡ob/ob小鼠的鈣黃綠素顯著增加,骨形成比野生型小鼠分別增加了70%和60%[7],而反映骨吸收功能的指標(biāo)脫氧吡啶諾林顯著高于野生型小鼠[10],盡管如此,ob/ob小鼠破骨細(xì)胞的數(shù)目卻出現(xiàn)增加[7]。這說明leptin基因及其受體基因敲除后,成骨細(xì)胞的骨形成功能和破骨細(xì)胞的骨吸收功能并未受到損壞,只是二者功能的平衡發(fā)生了變化。因此,盡管ob/ob小鼠和db/db小鼠出現(xiàn)的性腺功能衰退和皮質(zhì)酮增多癥本應(yīng)該誘導(dǎo)骨吸收,但是這2種基因敲除的小鼠均出現(xiàn)了骨量增加的現(xiàn)象,從而揭示出leptin信號途徑在骨骼代謝中的重要作用。

2 lep tin通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控骨骼代謝

骨骼的代謝是一個動態(tài)過程,是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能的統(tǒng)一體。ob/ob小鼠和db/db小鼠的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能在leptin信號缺失之后均受到了影響[7],因此leptin可能通過直接作用于成骨細(xì)胞或者破骨細(xì)胞來影響這2種細(xì)胞系的功能。有報道指出,在體外條件下leptin可以促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[11],Cornish等[12]通過實時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）研究表明leptin功能性受體在成骨細(xì)胞表達(dá),且在體外條件下能夠調(diào)控骨細(xì)胞的功能。但是lep tin受體同時存在于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此圍繞leptin到底是通過外周還是中樞途徑調(diào)控骨骼代謝一直存在爭議。Takeda等[13]的研究不認(rèn)為leptin是通過外周途徑調(diào)控骨骼代謝的,主要體現(xiàn)在:第一,體外原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞時,在培養(yǎng)基中添加生理水平的lep tin并未檢測到leptin的效應(yīng)分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）的磷酸化,只有當(dāng)leptin的添加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生理水平時才能觀察到成骨細(xì)胞的分化;第二,體外培養(yǎng)db/db小鼠的成骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn),缺失了leptin受體的成骨細(xì)胞系在體外產(chǎn)生的骨膠原低于野生型小鼠;第三,通過轉(zhuǎn)基因手段在成骨細(xì)胞中過量表達(dá)leptin并沒有對小鼠骨骼代謝產(chǎn)生顯著影響。為了解決lep tin到底是通過外周還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響骨骼代謝的問題,Shi等[14]通過基因工程手段分別特異性地敲除外周成骨細(xì)胞系和中樞下丘腦神經(jīng)元的leptin受體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性敲除外周成骨細(xì)胞系leptin受體的小鼠骨量沒有發(fā)生變化,但是特異性敲除中樞下丘腦神經(jīng)元lep tin受體的小鼠骨量顯著增加,證實leptin是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)來完成對骨量的調(diào)節(jié)的。

leptin發(fā)揮功能的途徑是通過與其受體結(jié)合啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來完成的,leptin的功能性受體在下丘腦的神經(jīng)元表達(dá)量極其豐富,這也進(jìn)一步提示leptin是通過下丘腦途徑來調(diào)控骨骼代謝的。Ducy等[7]、Takeda等[13]和Elefteriou等[15]對ob/ob小鼠進(jìn)行腦室灌注leptin,發(fā)現(xiàn)腦室灌注leptin可使ob/ob小鼠的骨量降低至野生型小鼠的水平。對羊連續(xù)3個月進(jìn)行腦室灌注leptin,發(fā)現(xiàn)其骨量顯著減少[16]。為了進(jìn)一步研究leptin作用于下丘腦的具體區(qū)域,Takeda等[13]用谷氨酸單鈉鹽（MSG）和硫金葡萄糖（GTG）分別特異性地破壞ob/ob小鼠的弓狀核（ARC）和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（VMH）,并且對以上2種小鼠模型的腦室內(nèi)灌注lep tin,發(fā)現(xiàn)ARC神經(jīng)元被破壞后,腦室灌注leptin仍然能夠繼續(xù)降低骨量,而VMH神經(jīng)元被破壞后,腦室灌注lep tin不影響骨量,說明lep tin是作用于VMH來調(diào)控骨骼代謝的。

3 交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）介導(dǎo)lep tin對骨骼代謝的調(diào)控

由于SNS在leptin基因缺失之后其活性受到了很大的影響[17],學(xué)者開始研究SNS對ob/ob小鼠骨骼代謝的影響。SNS系統(tǒng)的信號途徑主要是通過腎上腺素能受體來完成的,Takeda等[13]通過基因工程手段突變腎上腺素能受體的配體產(chǎn)生關(guān)鍵酶多巴胺β-羥化酶（DBH）,抑制體內(nèi)的腎上腺素和去甲腎上腺素（ISO）分泌,結(jié)果發(fā)現(xiàn),12月齡的DBH基因缺失（Dbh-/-）小鼠的骨量明顯增加,腦室灌注lep tin降低了Dbh-/-小鼠的脂肪沉積,但是卻沒有影響骨骼代謝,體現(xiàn)了SNS在lep tin調(diào)節(jié)骨骼代謝的過程中發(fā)揮著重要的信號傳遞作用。

M oore等[18]通過RT-PCR和Northern雜交發(fā)現(xiàn),只有成骨細(xì)胞存在腎上腺素能受體2 （Adrb2）,而破骨細(xì)胞不表達(dá)Adrb2的編碼基因。通過對1月齡ob/ob小鼠連續(xù)6個月進(jìn)行ISO處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISO處理的ob/ob小鼠骨量顯著減少,成骨細(xì)胞的數(shù)量和骨形成率下降,而用Adrb2的拮抗劑（β-blocker）處理卻得到相反的效果[13]。通過基因工程手段敲除Adrb2基因,發(fā)現(xiàn)Adrb2基因缺失（Adrb2-/-）小鼠的骨量顯著增加[15],而且該小鼠模型伴隨著leptin抵抗性的骨量增加[19]。人臨床上的研究表明,服用β-b locker的病人的骨密度增加[20],發(fā)生骨折的幾率下降[21-22],說明leptin通過SNS作用于成骨細(xì)胞的Adrb2影響骨骼代謝過程。

3.1 lep tin-SNS信號途徑對成骨細(xì)胞的影響

無論leptin通過哪種信號途徑發(fā)揮作用,均是通過影響成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的功能來實現(xiàn)的,因為這2種細(xì)胞系功能平衡的變化是導(dǎo)致骨量變化的直接原因。leptin基因及其受體基因被敲除后,成骨細(xì)胞的數(shù)目和功能都顯著提高[7,13],說明ob/ob小鼠和db/db小鼠的成骨細(xì)胞功能變化是導(dǎo)致高骨量的重要原因。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗,用野生型小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染Adrb2-/-小鼠,Adrb2-/-小鼠的骨量恢復(fù)正常,且在體外細(xì)胞分化時可檢測到野生型小鼠的成骨細(xì)胞;相反,用Ad rb2-/-小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型小鼠,野生型小鼠的骨量增加,且在體外細(xì)胞分化時可檢測到Adrb2-/-小鼠的成骨細(xì)胞,證明成骨細(xì)胞在lep tin-SNS信號途徑中發(fā)揮著重要作用[15]。

3.2 leptin-SNS信號途徑對破骨細(xì)胞的影響

ob/ob小鼠和接受β-b locker處理的野生型小鼠不僅成骨細(xì)胞的骨形成增加,而且破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收也顯著增加[7,13],但是Adrb2-/-小鼠在性腺摘除之后破骨細(xì)胞的骨吸收功能顯著降低[15],這與Ducy等[7]所發(fā)現(xiàn)的ob/ob小鼠和db/db小鼠在性腺衰退后骨吸收增加的結(jié)果迥異。Elef teriou等[15]在RANKL（成骨細(xì)胞的分化因子）、M-CSF （破骨細(xì)胞的增殖因子）存在的情況下培養(yǎng)野生型和Adrb2-/-小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這2種小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞均能夠分化到破骨細(xì)胞,而且敲除Adrb2基因和ISO處理均不影響破骨細(xì)胞的骨吸收功能和傳代,說明破骨細(xì)胞的功能并未受到影響,從而排除了SNS直接作用于破骨細(xì)胞的可能性。

交感信號的響應(yīng)受體Adrb2僅在成骨細(xì)胞表達(dá),推測lep tin-SNS信號途徑通過成骨細(xì)胞來間接調(diào)控破骨細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)野生型小鼠的成骨細(xì)胞和ISO共同培養(yǎng)時,增加了破骨細(xì)胞的傳代以及RANKL的表達(dá),但Adrb2-/-小鼠的成骨細(xì)胞和ISO共同培養(yǎng)卻沒有增加破骨細(xì)胞的傳代和RANKL的表達(dá),這說明leptin可以通過Adrb2上調(diào)成骨細(xì)胞分泌的RANKL來完成對破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[15]。

盡管ISO誘導(dǎo)的RANKL表達(dá)能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收,但是不能夠解釋Adrb2-/-小鼠在性腺摘除之后破骨細(xì)胞的骨吸收功能顯著降低這一現(xiàn)象,說明leptin誘導(dǎo)的SNS信號途徑在Ad rb2-/-小鼠中受到了其他因素的影響。鑒于此,研究人員將研究重點放到那些受到lep tin調(diào)控且基因失活之后不影響食欲和生育能力的基因。可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（CART）是一種內(nèi)源性神經(jīng)肽,研究發(fā)現(xiàn),CART的表達(dá)在ob/ob小鼠中降低,但是在Adrb2-/-小鼠上卻正常,而且CART基因缺失（Cart-/-）小鼠沒有明顯的內(nèi)分泌及繁殖系統(tǒng)的表型紊亂（排除代謝激素和繁殖激素的影響）,6月齡Cart-/-小鼠出現(xiàn)骨量降低,破骨細(xì)胞的表面積和數(shù)量增加了2倍,當(dāng)對Cart-/-小鼠腦室內(nèi)灌注leptin時,卻增加了骨量,說明leptin能夠通過CART調(diào)控破骨細(xì)胞的功能,抑制骨吸收[15]。Cart-/-小鼠的RANK L的表達(dá)量上升,說明CART是通過調(diào)控RANKL的表達(dá)來發(fā)揮功能的,從而體現(xiàn)lep tin還可以通過CART下調(diào)RANKL的表達(dá)減少破骨細(xì)胞的分化而增加骨量（圖1）。因此,leptin通過2種相反的方式來調(diào)控破骨細(xì)胞的功能:第一,通過SNS-Adrb2影響成骨細(xì)胞RANKL的分泌來促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化;第二,通過CART來抑制破骨細(xì)胞的分化。

圖1 leptin對破骨細(xì)胞分化的雙向調(diào)節(jié)Fig.1 Bidirectional regulation of lep tin on dif ferentiation of osteoclast

4 分子鐘（molecu lar clock）基因在leptin調(diào)控骨骼代謝中的作用

4.1 分子鐘對成骨細(xì)胞活性的影響

骨骼代謝包括破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成,二者的功能穩(wěn)衡對于骨骼的功能正常至關(guān)重要,由于這是一個穩(wěn)衡的過程,提示分子鐘可能參與了leptin對骨骼代謝的調(diào)控。Per是分子鐘基因的一種,通過敲除Per基因發(fā)現(xiàn),Per基因缺失（Per-/-）小鼠出現(xiàn)了顯著的骨量增加。當(dāng)用ISO分別處理野生型和Per-/-小鼠時,發(fā)現(xiàn)Per-/-小鼠成骨細(xì)胞的分子鐘基因的表達(dá)不受影響,而野生型小鼠卻顯著提高,說明成骨細(xì)胞的分子鐘基因通過SNS的調(diào)節(jié)來影響骨骼代謝。分析Per-/-小鼠的2種骨細(xì)胞系發(fā)現(xiàn):破骨細(xì)胞沒有受到影響,但是成骨細(xì)胞卻出現(xiàn)了顯著的增殖。通過細(xì)胞增殖試驗發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)16 h后,到達(dá)G2期的Per-/-小鼠成骨細(xì)胞的數(shù)量是野生型小鼠的3倍,且Per-/-小鼠成骨細(xì)胞的G1期細(xì)胞周期蛋白（cyclins）的表達(dá)量顯著高于野生型小鼠,說明Per基因可以調(diào)控成骨細(xì)胞的有絲分裂,延長細(xì)胞周期,降低細(xì)胞增殖的速度[23]。

4.2 分子鐘通過轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1（AP-1）促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖來增加骨量

Per-/-小鼠和Adrb2-/-小鼠在許多細(xì)胞和分子水平上的特點都是相似的,但是卻有一個比較特殊的現(xiàn)象,即當(dāng)腦室灌注leptin時,Per-/-小鼠的骨量增加,但是對Adrb2-/-小鼠卻沒有影響。這說明leptin-SNS除了通過分子鐘途徑抑制成骨細(xì)胞增殖之外,還可以通過lep tin-SNS的其他下游信號途徑增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能。研究成骨細(xì)胞增殖和分化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),c-fos（AP-1成員之一,能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,對于調(diào)控骨骼發(fā)育非常重要[24]）在Per-/-小鼠中的表達(dá)差異最為明顯,ISO處理之后c-fos是上調(diào)最明顯的基因。通過基因敲除手段發(fā)現(xiàn),當(dāng)同等密度下培養(yǎng)成骨細(xì)胞時,c-fos基因缺失（c-fos-/-）小鼠的成骨細(xì)胞生長速度明顯低于野生型小鼠,說明c-fos可控制成骨細(xì)胞分化。此外,受到分子節(jié)律基因調(diào)控的細(xì)胞周期基因c-myc和細(xì)胞周期蛋白D1 （cyclin D1）在c-fos-/-小鼠的成骨細(xì)胞中顯著下調(diào),說明leptin-SNS信號系統(tǒng)能夠通過AP-1來增加成骨細(xì)胞的增殖,這種途徑可能是通過增加一些細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)因子來完成的。成骨細(xì)胞的SNS能夠觸發(fā)2種相反的信號途徑調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖,而且還存在信號之間的交聯(lián),Per基因能夠下調(diào)AP-1的表達(dá),c-fos在Adrb2-/-小鼠中表達(dá)過量是由于這些細(xì)胞的分子鐘基因的表達(dá)下調(diào)所引起的。因此,在當(dāng)分子鐘的表達(dá)受到影響時,AP-1也可相應(yīng)地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)骨量[23]。lep tin通過SNS-Ad rb2對成骨細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)如圖2所示。

圖2 leptin通過SNS-Adrb2對成骨細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)Fig.2 Bidirectional regulation o f lep tin on p ro liferation of osteob last through SNS-Ad rb2

5 脂肪組織分泌的lep tin對骨骼代謝的調(diào)控

血液循環(huán)中的leptin主要來源于脂肪細(xì)胞, Elef teriou等[25]通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠下丘腦表達(dá)的lep tin極少,腦脊液中的lep tin主要來源于血液,通過轉(zhuǎn)基因手段提高血清leptin水平導(dǎo)致骨量降低,當(dāng)過量表達(dá)lep tin受體降低血清lep tin水平之后骨量升高,從而證明調(diào)控骨骼代謝的leptin來源于外周脂肪組織分泌的leptin,而并不是大腦分泌的lep tin。Prouteau等[26]對舉重運(yùn)動員的研究表明,與正常狀態(tài)相比,賽前體重減少導(dǎo)致血清leptin水平降低64%,賽后體重恢復(fù)后血清leptin水平升高276%,期間血清leptin水平的變化伴隨著骨吸收參數(shù)的顯著變化。因此,由外周脂肪組織分泌的lep tin是下丘腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控骨骼代謝的重要來源。

6 小 結(jié)

綜上可知,脂肪組織分泌的lep tin是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)對骨骼代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)的,但是leptin對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能均具有正負(fù)2方面的調(diào)控,正確認(rèn)識其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對于治療骨骼代謝疾病具有非常重要的作用。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:chendwz@sicau.edu.cn

（編輯 菅景穎）