林仕梅 羅 莉

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,淡水生物生殖與發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400716）

高密度精養(yǎng)模式的可持續(xù)發(fā)展,要求采用以高脂肪提供能量來(lái)節(jié)約蛋白質(zhì)的策略,進(jìn)而達(dá)到降低氮、磷排放,保護(hù)養(yǎng)殖水環(huán)境的目的。但當(dāng)飼料中脂肪水平超過(guò)需求量時(shí),會(huì)導(dǎo)致魚體的脂肪沉積增加,從而影響水產(chǎn)品品質(zhì)和貨架壽命,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致大量脂肪在魚肝細(xì)胞內(nèi)堆積,引起肝細(xì)胞變性、壞死,導(dǎo)致肝功能下降甚至衰竭,最后引起魚發(fā)病甚至死亡[1]。近年來(lái),魚粉價(jià)格居高不下,植物性蛋白源在羅非魚養(yǎng)殖中的使用量不斷加大,植物性蛋白源的不合理或大量使用會(huì)對(duì)羅非魚肝臟的生理機(jī)能帶來(lái)負(fù)面影響[2],使其處于亞健康狀態(tài),從而影響其正常的生長(zhǎng)。因此,如何保證養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物肝臟的健康,則成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和飼料生產(chǎn)者面臨的又一個(gè)難題。目前有關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物抗脂肪肝物質(zhì)的研究往往集中在單一物質(zhì)的使用效果上[3-5],而關(guān)于?；撬?、甜菜堿、左旋肉堿等這些抗脂肪肝物質(zhì)的復(fù)合使用還未見報(bào)道。為此,本試驗(yàn)以?shī)W尼羅非魚（Oreochrom is niloticus×O.aureus）為試驗(yàn)對(duì)象,在實(shí)用飼料配方的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚生長(zhǎng)和健康的影響,以便為防治魚類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝提供理論依據(jù)和解決方案。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)飼料

在實(shí)用飼料配方的基礎(chǔ)上,通過(guò)添加豆油,配制成3種脂肪水平的等氮（粗蛋白質(zhì)含量為30%）試驗(yàn)飼料,試驗(yàn)飼料1、2和3的脂肪水平分別為4.5%、6.5%和8.5%。在試驗(yàn)飼料3的基礎(chǔ)上添加0.1%的復(fù)合降脂因子（?；撬岍U甜菜堿︰左旋肉堿=3︰4︰2）,并相應(yīng)減少次粉的用量,配制成試驗(yàn)飼料4。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼料原料均粉碎過(guò)40目篩,飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃,分別制成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料,60℃烘干后,保存于-15℃冰柜中備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experimen taldiets（air-dry basis）%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚選用當(dāng)年培育的全雄性?shī)W尼羅非魚魚苗,取自廣東茂名三高魚種場(chǎng)。試驗(yàn)魚馴食適應(yīng)環(huán)境2周后,選取體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重為（4.21±0.09）g的奧尼羅非魚360尾,隨機(jī)分成4組,分別飼喂試驗(yàn)飼料1、2、3、4。每組設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾魚,放養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱（有效體積為200 L）中,日投喂率為體重的4%～8%,每天08:00、12:00和17:00各投喂1次,每2周稱重1次,調(diào)整投飼量。每天早上清除箱內(nèi)糞便,并換水1/ 3。飼養(yǎng)時(shí)間為8周。養(yǎng)殖水源曝氣自來(lái)水,試驗(yàn)期間水溫為（28.3±0.8）℃,pH為7.14±0.40,溶解氧為（6.25±0.70）m g/L,氨氮為（0.05± 0.01）mg/L。

1.3 樣品制備與分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,禁食1 d后稱重,每箱取3尾魚作為全魚體成分分析樣品;另取3尾魚采用搗毀脊髓法處死,取出肝胰臟,立即放入液氮罐中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。肝胰臟勻漿液在10 000×g4℃條件下離心30 m in,取上清液作為酶活性分析樣品,置-20℃冰箱待用。

飼料原料及魚體樣品均在105℃烘干至恒重,然后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。采用凱氏定氮法測(cè)定樣品的總氮含量,將測(cè)定結(jié)果乘以6.25即得粗蛋白質(zhì)含量,粗脂肪含量采用索氏抽提法,粗灰分含量采用高溫（550℃）灰化法測(cè)定[6]。

肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT,EC 2.6.1.1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT,EC 2.6.1.2）、超氧化物歧化酶（SOD,EC 1.15.1.1）、過(guò)氧化氫酶（CAT,EC 1.16.1.6）活性以及丙二醛（MDA）含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。GOT、GPT的活性單位定義為每毫克組織蛋白與基質(zhì)在37℃下作用60 m in,生成1μm ol丙酮酸所需要的酶;SOD的活性單位定義為每毫克組織蛋白在1m L反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所反應(yīng)的SOD量;CAT的活性單位定義為25℃,pH 7.0條件下,每分鐘分解1μm ol過(guò)氧化氫所需的酶。蛋白質(zhì)含量采用Brad ford[7]方法測(cè)定。

1.4 計(jì)算公式

特定生長(zhǎng)率（specific growth rate,SGR,%/d）= 100×[ln末重（g）-ln初重（g）]/試驗(yàn)天數(shù)（d）;

蛋白質(zhì)效率（protein ef ficiency ratio, PER,%）=100×魚體增重（g）/蛋白質(zhì)攝人量（g）;

飼料系數(shù)（feed conversion ratio,FCR）=總干物質(zhì)攝食量（g）/魚體總增重（g）;

臟體比（viscerosomatic index,VSI,%）= 100×內(nèi)臟重濕重（g）/魚體重濕重（g）;

肝體比（hepatosomatic index,HSI,%）= 100×肝胰臟重濕重（g）/魚體重濕重（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

除成活率外,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS 11.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-w ay ANOVA）,若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行Tukey多重比較,顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的SGR顯著增加（P＜0.05）。羅非魚的FCR隨著飼料脂肪水平的增加而降低,其中1組顯著高于2組和3組（P＜0.05）。羅非魚的PER表現(xiàn)出與FCR相反的趨勢(shì),即隨飼料脂肪水平的增加而升高,其中3組顯著高于1組（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,羅非魚的FCR顯著降低（P＜0.05）,PER顯著升高（P＜0.05）,SGR有上升的趨勢(shì)（P＞0.05）。試驗(yàn)期間,各試驗(yàn)組羅非魚的成活率均為100%。

表2 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effec ts of dietary lipid level and compound lipotropic agent on grow th perform ance of tilapia

2.2 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚體組成的影響

由表3可知,各組羅非魚的臟體比和肝體比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。羅非魚的肝脂和體脂（魚體粗脂肪）含量3組顯著高于其他各組（P＜0.05）,而其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚魚體干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量的影響差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚體組成的影響Tab le 3 Effects of dietary lipid level and com pound lipotropic agent on body composition o f tilapia%

2.3 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚肝胰臟代謝、抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT活性均顯著降低（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT活性顯著提高（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。4組羅非魚的肝胰臟SOD活性顯著低于2組和3組（P＜0.05）,其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的肝胰臟CAT活性顯著升高（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟SOD和CAT活性顯著降低（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。羅非魚的肝胰臟MDA含量隨著飼料脂肪水平的增加而升高,且3組顯著高于1組和2組（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟MDA含量顯著降低（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 飼料脂肪水平和復(fù)合降脂因子對(duì)羅非魚肝胰臟代謝、抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary lipid level and com pound lipotropic agent on indices ofm etabolic and antioxidant in hepatopancreas of tilapia

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的生長(zhǎng)性能提高,以8.5%脂肪水平生長(zhǎng)效果最好,這與Hanley[8]的研究結(jié)果一致。Jauncey等[9]建議羅非魚飼料中的脂肪水平為6%～10%,也有研究指出羅非魚幼魚飼料中適宜的脂肪水平為12%[10],而甘暉等[11]研究指出奧尼羅非魚幼魚飼料中適宜的脂肪水平為4%（半純化飼料）。造成這種差異的原因可能與飼料脂肪酸組成、飼料配方、魚類生長(zhǎng)階段、飼養(yǎng)條件等有關(guān)。本研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)立足我國(guó)的生產(chǎn)實(shí)際,其脂肪水平也符合羅非魚的建議需求量。高能飼料固然能提高飼料效率,并降低氨氮、磷及有機(jī)物的排放,但容易提高動(dòng)物體脂水平,降低產(chǎn)品品質(zhì)[12]。已有研究指出羅非魚飼料中脂肪水平達(dá)到6%時(shí),會(huì)產(chǎn)生一定的蛋白質(zhì)節(jié)約效應(yīng)[13]。但本研究中各脂肪水平均沒有表現(xiàn)出明顯的蛋白質(zhì)節(jié)約效果,僅在脂肪水平為8.5%時(shí)表現(xiàn)出體脂含量的提高。Han ley[8]研究指出在飼料蛋白質(zhì)不缺乏的情況下,羅非魚不能有效利用脂肪作為能源。本研究是否是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水平較高使得蛋白質(zhì)節(jié)約效應(yīng)沒表現(xiàn)出來(lái)值得進(jìn)一步探討。此外, Chou等[10]在尼羅羅非魚上的研究發(fā)現(xiàn),高脂肪水平會(huì)降低其產(chǎn)脂酶的活性。

眾所周知,脂肪是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)重要的貯能物質(zhì),但飼料中脂肪含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致魚體出現(xiàn)脂肪肝[2]。肝脂含量的多少是反映肝健康的重要指標(biāo),本研究中高脂肪水平（8.5%）使得羅非魚肝脂含量顯著增加,盡管沒有影響羅非魚的生長(zhǎng)性能（可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)養(yǎng)殖周期僅僅為8周）,但長(zhǎng)時(shí)間飼喂不可避免的會(huì)加重肝臟負(fù)荷,降低肝的生理機(jī)能,影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能,嚴(yán)重的甚至?xí)痿~類死亡。魚類的肝脂主要來(lái)自對(duì)飼料中脂肪的直接吸收以及飼料中過(guò)量蛋白質(zhì)和糖類的轉(zhuǎn)化合成,因此,可以通過(guò)調(diào)節(jié)和控制肝臟中脂肪的來(lái)源和去路,實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪肝的預(yù)防和治療。目前研究發(fā)現(xiàn),?；撬醄14-15]、甜菜堿[16-17]、左旋肉堿[18]是魚類較理想的抗脂肪肝因子,飼料中補(bǔ)充這些物質(zhì)能夠有效降低水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物肝脂含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,上述物質(zhì)的復(fù)合使用亦能夠有效降低羅非魚肝脂含量,改善羅非魚的生理機(jī)能。由于這些抗脂肪肝物質(zhì)具有不同的生理生化機(jī)制以及抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物脂肪肝形成的作用機(jī)理不同,因此,如何調(diào)配好這些物質(zhì)來(lái)有效降低養(yǎng)殖動(dòng)物肝脂含量,是值得進(jìn)一步深入研究的問題。

當(dāng)魚類肝臟病變時(shí)（如脂肪肝）,由于肝組織的損傷,導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞或細(xì)胞膜通透性增加,致使肝細(xì)胞中的酶滲入血液,使血液中的酶活性增加[2]。因此,肝胰臟轉(zhuǎn)氨酶活性反映了肝胰臟受損傷的程度,肝胰臟GPT、GOT活性越低,表明肝臟受損傷越嚴(yán)重。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料脂肪水平增加,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT酶活性顯著降低;在8.5%脂肪水平下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT酶活性又顯著升高（P＜0.05）。這表明復(fù)合降脂因子對(duì)肝臟起到一定的保護(hù)作用,從而促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。

MDA是脂肪酸過(guò)氧化代謝產(chǎn)物,被認(rèn)為是肝臟損傷的指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中,脂肪水平為8.5%時(shí)羅非魚肝胰臟的MDA含量較其他脂肪水平增加了近1倍,這表明羅非魚肝臟脂肪過(guò)度沉積的同時(shí)大量脂肪酸發(fā)生了過(guò)氧化。魚體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)去除脂肪酸氧化產(chǎn)物,以維持正常的生理功能,其中包括CAT、SOD等抗氧化酶[20]。動(dòng)物細(xì)胞生存要求適當(dāng)?shù)难趸c抗氧化平衡,但脂肪酸被氧化的量一旦超過(guò)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除能力,肝臟可能產(chǎn)生更嚴(yán)重的損害。CAT和SOD分別作用于過(guò)氧化氫和超氧自由基。SOD是底物誘導(dǎo)酶,它的活性升高說(shuō)明體內(nèi)超氧自由基或羥自由基含量上升,從而導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)氧化壓力過(guò)大;CAT能特異性清除體內(nèi)過(guò)多的過(guò)氧化氫,保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化損傷,這2種酶的測(cè)定常用于間接反映體內(nèi)自由基反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化及組織損傷情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著飼料脂肪水平增加,羅非魚肝胰臟SOD和CAT活性均有不同程度的升高,這表明魚體處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)。而在8.5%高脂肪水下添加0.1%復(fù)合降脂因子后,SOD和CAT活性得到顯著改善,這說(shuō)明復(fù)合降脂因子具有很好的抗氧化活性,推測(cè)其肝臟保護(hù)作用可能是源于其較高的體內(nèi)抗氧化活性。

4 結(jié) 論

①增加飼料脂肪水平會(huì)顯著提高羅非魚的生長(zhǎng)性能,但高脂肪水平（8.5%）會(huì)降低羅非魚肝臟的生理機(jī)能。

②添加復(fù)合降脂因子能夠顯著改善羅非魚肝脂含量和肝胰臟酶活性,繼而促進(jìn)生長(zhǎng)。

③復(fù)合降脂因子可以作為一種安全高效的口服保肝劑應(yīng)用于羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

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Au thor,LIN Sh imei,associate professor,E-mail:linsm198@163.com

（編輯 菅景穎）