欒家杰馬張慶宋建國

（1皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院藥劑科，安徽 蕪湖 241001；2皖南醫(yī)學院臨床藥學研究所；3皖南醫(yī)學院定量藥理研究所）

莫達非尼對小鼠中樞谷氨酸水平的影響

欒家杰1,2馬張慶3宋建國3

（1皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院藥劑科，安徽 蕪湖 241001；2皖南醫(yī)學院臨床藥學研究所；3皖南醫(yī)學院定量藥理研究所）

【摘要】目的：通過研究莫達非尼（modafinil，MOD）用藥后小鼠各腦區(qū)谷氨酸含量的變化，探討MOD中樞興奮作用的可能機制。方法：MOD灌胃給藥，測定給藥后小鼠腦部各分區(qū)谷氨酸含量。結(jié)果：MOD使小鼠大腦皮層谷氨酸含量顯著增加，該作用呈劑量依賴性，但對其他腦區(qū)谷氨酸水平無顯著影響。結(jié)論：MOD用藥后使小鼠大腦皮層谷氨酸含量明顯升高，可能與其中樞興奮作用機制有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】莫達非尼；腦藥濃度；谷氨酸

莫達非尼（modafinil，MOD）是一種新型中樞興奮藥，具有促覺醒、抗帕金森病、增強認知能力以及抗疲勞等作用[1-6]，臨床主要用于嗜睡、發(fā)作性睡病和抑郁癥的治療。MOD中樞興奮機制十分復(fù)雜，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛的影響。文獻報道，MOD可激動藍斑核α1腎上腺素受體，而對藍斑核以外的去甲腎上腺素能神經(jīng)無明顯作用[7]。MOD能促進并能較長時間維持大腦皮層興奮狀態(tài)，人或動物在用藥后均可在較長時間內(nèi)保持清醒狀態(tài)[8]；對發(fā)作性睡病患者，MOD白天用藥可顯著減少發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時間[9]。

與傳統(tǒng)中樞興奮藥如苯丙胺等相比，MOD在興奮中樞、增加動物自主活動的同時，無明顯心血管不良反應(yīng)，也無明顯依賴性[10]，提示本品有完全不同于傳統(tǒng)精神興奮藥物的作用機制。MOD這一特點已引起研究者的廣泛興趣和重視。但迄今為止，MOD的確切作用機制仍然尚未闡明，對其量效關(guān)系也未見詳盡報道。

本研究擬通過研究不同劑量莫達非尼給藥后小鼠腦部各分區(qū)谷氨酸含量的變化，為進一步研究MOD中樞興奮作用的可能機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

1.1.1 實驗動物雄性昆明種小鼠140只，體重（22±2.5）g，由南京青龍山動物繁殖中心提供（許可證號：SCXK（蘇）2007-0001）。動物分籠飼養(yǎng)，控制室溫（25±2℃）和濕度（＜60%），控制室內(nèi)12 h明暗周期。動物可自由進食、進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗前禁食12 h。

1.1.2 實驗分組隨機取128只上述動物，分為MOD 120 mg/kg組和對照組，每組64只，該組動物灌胃給藥后，分別于給藥前和給藥后規(guī)定時間點分批處死動物，測定各腦區(qū)谷氨酸含量。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，再取12只上述動物，分為MOD 60 mg/kg組、MOD 240 mg/kg組，灌胃給藥，在給藥后1.5 h處死小鼠，分離出大腦皮層區(qū)域，測定谷氨酸含量，結(jié)合MOD 120 mg/kg組和對照組的實驗結(jié)果分析量效關(guān)系。

1.2 藥品、試劑和儀器

1.2.1 藥品與試劑莫達非尼（純度≥99%，中國藥科大學醫(yī)藥化工研究所提供）；乙腈（色譜純，上海科豐化學試劑有限公司）；乙酸鈉（分析純，合工大化學試劑廠）；檸檬酸（分析純，恒源精細化工有限公司）；藥品和試劑配制用水均為二次蒸餾水。

1.2.2 主要儀器Agilent高效液相色譜儀：二元泵、柱溫箱、熒光檢測器，自動進樣器；PRO200電動勻漿器；CR22GⅡ高速低溫離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥方法與取樣時間灌胃給藥，對照組給予等量生理鹽水，分別于給藥前和給藥后0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6 h分批處死動物（n=8），測定各腦區(qū)谷氨酸含量。

1.3.2 腦部分區(qū)及腦勻漿制備將全腦分成七個分區(qū)：皮層（cortex）、紋狀體（striatum）、海馬（hippocampus）、丘腦（thalamus）、中腦（midbrain）、小腦（cerebellum）和延腦－橋腦（medulla pons-oblongata）。

小鼠斷頭處死，取腦組織稱重，按1∶4（4 μL/mg）加入生理鹽水，20 000 r/min，20 sec制備腦勻漿。取腦勻漿0.2 mL，加入7%高氯酸200 μL，混勻1 min，4℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣，分析MOD濃度。

1.3.3 標準曲線制備空白腦勻漿精密加入MOD標準品配成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L標準液。取標準液0.2 mL，加7%高氯酸200 μL沉淀蛋白，4℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣分析，建立MOD腦勻漿標準曲線。

1.3.4 谷氨酸測定方法采用高效液相色譜法測定谷氨酸濃度。色譜條件：流動相為0.1M乙酸鈉/檸檬酸緩沖液（pH5.4）－乙腈60∶40（v/v），含EDTA·2Na 0.1 mM；流速為1.0 mL/min；Agilent SB-C8（4.6×150 mm）色譜柱；熒光檢測器激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm；柱溫30℃。

熒光反應(yīng)劑制備：A液：0.1 M NaHCO3/NaCO3（pH9.6）緩沖液；B液：OPA 10 mg，加乙醇1 mL，再加2巰基乙醇5 μL，老化24 h；用時A液800 μL加B液200 μL混合。進樣方法：抽取熒光反應(yīng)劑10 μL，抽取樣品20 μL，再抽取熒光反應(yīng)劑10 μL，靜置1 min，進樣40 μL。

1.3.5 回收率和精密度按1.3.3方法，配置高、中、低（10、2.0、0.5mg/L）三種濃度的谷氨酸標準樣，分別在同日內(nèi)及不同日間進行處理后分析，測試方法的精密度，并按檢出量與加入量計算相對回收率。上述三個濃度樣本的日內(nèi)精密度分別為1.25%、4.87%和6.79%；日間精密度分別為2.48、3.16% 和8.12%。三種濃度樣本的相對回收率分別為99.12%、96.34%和85.71%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 MOD對小鼠七個腦區(qū)谷氨酸水平的影響

MOD用藥后，監(jiān)測小鼠腦部七個分區(qū)谷氨酸水平，發(fā)現(xiàn)MOD 120 mg/kg劑量組用藥后1.5 h小鼠大腦皮層谷氨酸含量明顯增加（P＜0.01），其余六個腦區(qū)：紋狀體、海馬、丘腦、中腦、小腦及延腦－橋腦的谷氨酸水平與對照組相比，無明顯變化（圖1）。

圖1 莫達非尼口服給藥后1.5h不同腦區(qū)谷氨酸含量(n=8)注：**P＜0.01，與空白溶媒組相比

2.2 MOD用藥后小鼠大腦皮層谷氨酸含量的經(jīng)時變化

MOD 120 mg/kg劑量組用藥后，小鼠大腦皮層谷氨酸水平經(jīng)時變化曲線見圖2。用藥后1～4 h，大腦皮層谷氨酸含量與對照組相比有顯著的統(tǒng)計學意義。

圖2 莫達非尼口服給藥后小鼠皮層谷氨酸水平經(jīng)時變化（n=8）注：*P＜0.05，**P＜0.01，與空白溶媒組相比

2.3 MOD給藥劑量－給藥后大腦皮層谷氨酸含量的相關(guān)性

MOD使小鼠大腦皮層谷氨酸含量增加呈明顯的劑量依賴性。在60～240 mg/kg劑量范圍內(nèi)，隨著給藥量增加，大腦皮層谷氨酸含量也隨之增加，r=0.860 4，呈良好相關(guān)性（P＜0.01，圖3）。

圖3 莫達非尼對于小鼠皮層谷氨酸水平的劑量依賴性作用(n=6)

3 討論

莫達非尼自問世以來，研究者對其中樞興奮效應(yīng)進行了大量研究，多數(shù)集中于該藥對睡眠及自主活動的影響。關(guān)于MOD中樞作用的確切機制，至今仍不清楚。有文獻報道，MOD可對中樞興奮性遞質(zhì)5-HT、DA、NA和抑制性遞質(zhì)GABA產(chǎn)生影響[11-13]。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的興奮性遞質(zhì)，關(guān)于MOD對中樞谷氨酸水平的影響，尚甚少報道。Ferraro等證實，MOD能使內(nèi)側(cè)視前區(qū)（media preoptic area，MPA）和下丘腦后部（posterior hypothalamus，PH）GABA水平降低[14]。該研究還提示，MOD不僅通過單胺遞質(zhì)發(fā)揮作用，還可能對谷氨酸系統(tǒng)產(chǎn)生影響。MOD是否會引起部分腦區(qū)，尤其是大腦皮層谷氨酸含量發(fā)生改變？迄今尚未見進一步的研究報告。

本實驗對MOD用藥后小鼠腦部七個腦區(qū)的谷氨酸水平進行了監(jiān)測，證實MOD用藥后，小鼠大腦皮層的谷氨酸水平明顯升高（P＜0.01），而其他六個腦區(qū)：紋狀體、海馬、丘腦、中腦、小腦及延腦－橋腦的谷氨酸水平未見明顯改變（P＞0.05）。且MOD這一作用呈明顯的劑量依賴性。大腦皮層興奮性遞質(zhì)及抑制性遞質(zhì)水平的高低，一般可直接影響皮層的興奮狀態(tài)。該結(jié)果提示，MOD的中樞興奮作用可能至少部分地與其升高大腦皮層興奮性遞質(zhì)谷氨酸的水平有關(guān)。MOD使大腦皮層谷氨酸水平升高作用的詳盡機制和意義尚有待進一步研究。

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基金項目：皖南醫(yī)學院中青年科研基金資助項目（WK200703F）

作者簡介：欒家杰，男，博士在讀，主管藥師，講師。研究方向：臨床藥學及定量藥理學。E-mail:luanjiajie757@medmail.com.cn宋建國，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。通訊作者 E-mail:cpyjsyy@126.com

Effects of Modafinil on Concentration of Glutamic Acid in Mouse

Luan Jiajie1,2，Ma Zhangqing3,Song Jianguo3
(1Department of pharmacy，Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001，China;2 Laboratory of Clincal Pharmacy of Wannan Medical College;3 Laboratory of quantitative pharmacology of Wannan Medical College)

ABSTRACTObjective：To determine the glutamic acid content in seven different brain regions of mice,and to explore possible mechanism of central neural system stimulation of MOD.Methods：After oral administration of MOD, the content of glutamic acid was assessed in mouse brain to discuss the possible central stimulation mechanism of MOD.Results：Glutamic acid content in mouse cortex significantly increased after treatment of MOD and had a significant correlation with the brain drug concentration.Conclusion：MOD is easy to get through the blood-brain barrier and wildly distributed in the mouse brain.MOD effectively increases glutamic acid level in mouse cortex,which can be probably involved in the central stimulation of MOD.

KEY WORDSModafinil;Brain Drug Concentration;Glutamic Acid