陳維

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

1 細(xì)胞培養(yǎng)的研究歷程

1885年，Roux最早使用溫生理鹽水使雞胚組織在體外生存長達(dá)數(shù)月，開啟了體外組織培養(yǎng)的萌芽時(shí)代。1907年，美國胚胎學(xué)家Ross Harrison 采用青蛙淋巴液做培養(yǎng)基，懸滴法使蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織在體外得以生長，從而建立了動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本模式系統(tǒng)。之后又有許多學(xué)者對細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，1912年，Carrel采用血漿包埋組織塊外加胚汁的培養(yǎng)方法（懸滴法的一種），培養(yǎng)雞胚心肌組織長達(dá)數(shù)年之久。從此，細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)建立起來。之后，科學(xué)家又在懸滴法的基礎(chǔ)上，不斷進(jìn)行改進(jìn)，優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法、三維立體細(xì)胞培養(yǎng)法。利用體外培養(yǎng)技術(shù)，科學(xué)家建立了可以長期在體外生長培養(yǎng)的細(xì)胞株，其中，1943年，Earle建立的小鼠皮下組織L細(xì)胞株是最早建立的細(xì)胞株，給研究工作帶來了很大的方便。在此基礎(chǔ)上又相繼建立了許多細(xì)胞株，如Hela（1952年）、KB（1954年）、CHO（1957年）、NIH3T3（1970年）、Friend（1974年）、HL60（1977年）、COS-1（1981年）等。

目前細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究。另外在醫(yī)學(xué)方面也有很重要的應(yīng)用價(jià)值。由于經(jīng)過體外培養(yǎng)的細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)功能都十分接近體內(nèi)情況，因此他們可以作為生物學(xué)的研究對象從而替代某些珍稀物種、進(jìn)行醫(yī)學(xué)鑒定等。

縱使研究者想盡各種方法盡可能的模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境使其在體外進(jìn)行與體內(nèi)同樣的生長和傳代，但是始終無法做到完全相同。除了需要滿足水分、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及溫度、pH、滲透壓等物質(zhì)和條件外，還需要生長因子等特殊的成分，體外的細(xì)胞才可能達(dá)到與體內(nèi)近乎相同的生長形態(tài)。

2 生長因子的發(fā)現(xiàn)

1986年，Levi-montalcini和Stanley Cohen因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子和表皮生長因子以及它們的作用特征而榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎[1]。神經(jīng)生長因子（NGF）是最先被發(fā)現(xiàn)的生長因子。20世紀(jì)50年代初，Levi-montalcini在美國華盛頓大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行外周組織對神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活之影響的研究中發(fā)現(xiàn)：把鼠的腫瘤移植到雞的胚胎中，可產(chǎn)生一種彌散性的物質(zhì)，這種物質(zhì)能夠刺激神經(jīng)細(xì)胞的生長。并在以后的工作中與Stanley Cohen利用組織培養(yǎng)的方法分離出這種物質(zhì)，命名為神經(jīng)生長因子。Levi-montalcini不但是神經(jīng)生長因子最早的發(fā)現(xiàn)者，她同時(shí)也是最早向體外培養(yǎng)細(xì)胞中加入生長因子的科學(xué)家。在隨后的幾十年中，科學(xué)家確定了NGF的化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制。1962年，Stanley Cohen在實(shí)驗(yàn)中，將含有NGF的唾液腺細(xì)胞提取物注射到新生小鼠體內(nèi)時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠的眼皮及牙齒有早熟的現(xiàn)象。因?yàn)檫@種物質(zhì)能刺激皮膚及角膜中表皮細(xì)胞的生長，Stanley Cohen稱之為表皮生長因子（EGF），之后，他又明確了EGF的結(jié)構(gòu)[2]。

EGF和NGF的發(fā)現(xiàn)以及之后對它們結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制的研究過程中，組織和器官的體外培養(yǎng)技術(shù)發(fā)揮了很重要的作用。因?yàn)檠芯空呤窃谟^察整個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體時(shí)，發(fā)現(xiàn)了這一物質(zhì)，但如果想進(jìn)一步證實(shí)是一種新物質(zhì)，就必須進(jìn)行細(xì)胞的體外培養(yǎng)才能盡可能的排除個(gè)體中其他物質(zhì)對其的干擾，使實(shí)驗(yàn)更有說服力。

Levi-montalcini和Stanley Cohen開創(chuàng)了研究生長因子的新領(lǐng)域，越來越多的研究者投身其中。各種不同功能的生長因子也相繼被發(fā)現(xiàn)：20世紀(jì)80年代，在Moloney小鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的3T3纖維母細(xì)胞條件化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子[3]；1982年Gambarini等從牛垂體分離、純化了酸性成纖維細(xì)胞生長因子；在兩年后Bohlen等，取牛腦或垂體經(jīng)CMSephadex C-50，肝素-Sepharose親和層析，獲得了純化的堿性成纖維細(xì)胞生長因子[4]。

3 生長因子的分類

根據(jù)每種生長因子最初的發(fā)現(xiàn)組織不同，可以將生長因子分為神經(jīng)細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及各種組織生長因子。各種生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的形態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。神經(jīng)細(xì)胞生長因子是最早被發(fā)現(xiàn)目前研究最為透徹的生長因子，它具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促突起生長雙重生物學(xué)功能，并對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞生長因子可以抑制某些腫瘤的有絲分裂，促其向良性分化，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤的體外培養(yǎng)細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)分化作用[5]。神經(jīng)細(xì)胞生長因子能否成為臨床治療惡性腫瘤的一種新制劑，有待于進(jìn)一步研究。表皮生長因子是最早確立結(jié)構(gòu)的生長因子，表皮生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂以及糖、蛋白質(zhì)、DNA、RNA合成；在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)可以抑制細(xì)胞的衰老[6]，最近的研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子對于傳代培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細(xì)胞[7]以及體外培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞[8]的增殖具有一定的促進(jìn)作用。成纖維細(xì)胞生長因子又可以分為酸性成纖維細(xì)胞生長因子和堿性成纖維生長因子，二者均可以在體外環(huán)境下刺激中胚葉來源的成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，另外堿性FGF還是有效的血管生成劑。研究證實(shí)，堿性FGF可以刺激體外兔干細(xì)胞的增殖和代謝[9]。

生長因子還可以分為內(nèi)源性生長因子和外源性生長因子，外源生長因子即直接從生物體提取的成品生長因子，但是實(shí)驗(yàn)中通常采用轉(zhuǎn)染的方法將編碼生長因子的基因序列導(dǎo)入到受體細(xì)胞中，從而使生長因子在細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化和繁殖。內(nèi)源性生長因子較外源性生長因子的優(yōu)點(diǎn)在于它可以在細(xì)胞體內(nèi)持續(xù)高效的發(fā)揮作用，還可以通過調(diào)控釋放來避免由于一次大量給藥而產(chǎn)生的潛在藥物毒性，能為組織再生提供最佳的有效劑量[10]。

3.1 外源轉(zhuǎn)內(nèi)源的原因

現(xiàn)階段在細(xì)胞培養(yǎng)中使用的生長因子多為外源型的，即直接在培養(yǎng)基中加入成品生長因子，外源生長因子的半衰期短，局部使用容易被稀釋，而且需要反復(fù)給藥。另外，無論從濃度上還是從生長因子的種類上說都是憑經(jīng)驗(yàn)，沒有具體的加入劑量和加入種類。因此在實(shí)驗(yàn)中生長因子的量同樣也是影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素之一。再者，現(xiàn)階段使用的生長因子大多是從胎牛血清中提取的，價(jià)格相對來說較昂貴，不適合在實(shí)驗(yàn)中廣泛使用。如果將編碼生長因子的基因?qū)氲酱囵B(yǎng)的細(xì)胞基因組中，使其成為內(nèi)源型生長因子，可以大大降低生長因子的成本，另外對于細(xì)胞所需要的生長因子的濃度可以通過基因調(diào)控來控制，從而使生長因子在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮最重要的作用。由于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往不僅僅只加入一種生長因子，因此在制備內(nèi)源型生長因子時(shí)可以一次性將多種生長因子的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中，以表達(dá)不同的生長因子。

3.1.1 轉(zhuǎn)染生長因子基因的步驟

目前在干細(xì)胞培養(yǎng)及促進(jìn)細(xì)胞分化中應(yīng)用細(xì)胞生長因子的例子比較多，例如將胰島素樣生長因子的基因轉(zhuǎn)染至兔脂肪間質(zhì)干細(xì)胞中以促進(jìn)細(xì)胞的增值[10]。主要實(shí)驗(yàn)方法如下：對以獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代；細(xì)胞活力、密度以及各特性的鑒定；符合條件后，將含有生長因子基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中并進(jìn)行傳代培養(yǎng)；以未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的細(xì)胞作為空白對照，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的鑒定。主要的鑒定方法有：應(yīng)用RT-PCR對生長因子mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定；應(yīng)用Western blot法檢測生長因子蛋白的表達(dá)情況。

4 生長因子作用的分子學(xué)機(jī)制

生長因子作為一種信號分子它是一種局部介質(zhì)，它能夠調(diào)節(jié)多細(xì)胞生物的細(xì)胞生長和分裂，作用的靶細(xì)胞主要是臨近的細(xì)胞。由于生長因子的大多數(shù)是親水性物質(zhì)，因此它不能穿過靶細(xì)胞質(zhì)膜的脂雙分子層，只能通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，在經(jīng)信號轉(zhuǎn)換機(jī)制，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使或激活蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性，從而引起細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長。不同的生長因子具有不同的受體進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：表皮生長因子的受體為，酪氨酸既沒活性的多功能跨膜糖蛋白；神經(jīng)細(xì)胞生長因子的受體為，低親和力的神經(jīng)生長因子受體和高親和力的酪氨酸激酶家族受體；成纖維細(xì)胞生長因子的受體有三種，酪氨酸激酶受體、富胱氨酸成纖維細(xì)胞生長因子受體以及低親和力的受體肝素硫酸糖蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子的受體為，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體。

5 各種生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的研究歷程

5.1 神經(jīng)細(xì)胞生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

神經(jīng)生長因子是最早被發(fā)現(xiàn)的生長因子，同時(shí)它也是最早應(yīng)用于體外細(xì)胞的一類生長因子，在Levi-montalcini發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了神經(jīng)細(xì)胞生長因子存在后，它向體外培養(yǎng)的雞胚中加入該生長因子，觀察其對雞胚中神經(jīng)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞生長因子能使感覺神經(jīng)節(jié)及交感神經(jīng)節(jié)數(shù)目增加，體積增大，神經(jīng)纖維延長。神經(jīng)細(xì)胞生長因子對正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化及維持神經(jīng)元特殊功能有重要的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起修復(fù)、營養(yǎng)作用[11]。神經(jīng)細(xì)胞生長因子不僅對神經(jīng)系統(tǒng)，而且對內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)都發(fā)揮重要的作用，是一種能抵抗各種疾病的全能武器，正如Levi-Montilini所說，NGF的臨床應(yīng)用有著迷人的希望。

在對細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的時(shí)候，NGF也經(jīng)常被用到。研究發(fā)現(xiàn)，在觀察神經(jīng)生長因子對體外培養(yǎng)的垂體催乳素瘤細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)NGF可以刺激人的垂體PRL分泌腺瘤細(xì)胞激素從而間接起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用最適合，所使用濃度為2 ng/μl[12]；NGF還可以促進(jìn)人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，其濃度為100 U/mL時(shí)刺激細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度為1000 U/mL時(shí)反而會抑制細(xì)胞的增殖[13]。

5.2 表皮細(xì)胞生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

目前表皮生長因子多用于臨床，體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞覆蓋燒燙傷創(chuàng)面，對成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞以及癌前病變的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等具有促增生的作用?？梢酝ㄟ^向無血清的培養(yǎng)基中添加生長因子的方法精細(xì)研究生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用[14]，結(jié)果顯示表皮生長因子可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖、細(xì)胞生長和分化。正常的表皮細(xì)胞角質(zhì)化死亡是一種特異類型的生理性細(xì)胞凋亡，但是表皮細(xì)胞凋亡也可由環(huán)境因素誘導(dǎo)發(fā)生，如低溫、熱休克、紫外線、射線，超氧化物、干擾素及細(xì)胞毒等都具有觸發(fā)凋亡的作用。細(xì)胞的過度或持續(xù)凋亡會造成細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)破壞、DNA損傷與突變、基因穩(wěn)定性喪失、基因表達(dá)模式的改變，表現(xiàn)出細(xì)胞增殖和生長的抑制。實(shí)驗(yàn)證明在表皮生長因子存在的情況下，凋亡的發(fā)生率很低，細(xì)胞生長健壯并具有分裂的形態(tài)特征，反之，細(xì)胞則表現(xiàn)為典型的凋亡形態(tài)[15]。

不同濃度的表皮生長因子對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不同，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著表皮生長因子濃度的增加，其對細(xì)胞的促增生作用也不斷增強(qiáng)，超過此范圍后，隨著其濃度的增加這種促增生作用有所下降，甚至?xí)a(chǎn)生抑制效應(yīng)。這可能與表皮生長因子的受體消耗以及細(xì)胞自身的負(fù)反饋有關(guān)，效濃度的重要性，否則過度的使用該因子會產(chǎn)生負(fù)面的效果，影響臨床效果[8]。細(xì)胞的增殖和生長對于生長因子濃度不盡相同，如在角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代是要求的濃度為10 ng/mL[16]，在培養(yǎng)人角質(zhì)細(xì)胞增殖是最適濃度為0.1-1 ng/mL[8]，在傳代培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細(xì)胞時(shí)最適濃度為1 ng/mL[7]。

5.3 成纖維細(xì)胞生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

FGF是一種多功能的肝素結(jié)合的蛋白質(zhì)，但是這種多功能作用多與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，它可以協(xié)同其它神經(jīng)營養(yǎng)因子作用，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)和感覺系統(tǒng)細(xì)胞的生長[17]。FGF可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，加快細(xì)胞倍增，尤其能縮短細(xì)胞周期的G1期的時(shí)間。FGF對中胚層來源細(xì)胞是一個(gè)強(qiáng)有力的致分裂源。同時(shí)，它可以穩(wěn)定細(xì)胞的表現(xiàn)型、促進(jìn)細(xì)胞的定向分化并且有明顯的延緩細(xì)胞老化、促進(jìn)傷口愈合和血管生成的作用[18]。人和小鼠的FGF6基因以及它的產(chǎn)物可以促進(jìn)肌肉細(xì)胞的生長[19]。

近幾年FGF在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用主要有：bFGF在濃度為10～100 ng/ml時(shí)對小鼠和兔的胚胎脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長和發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用，但是當(dāng)bFGF的濃度為200 ng/ml時(shí)則會抑制細(xì)胞的生長和發(fā)育，細(xì)胞的存活率明顯下降[20，21]；aFGF對體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞有明顯的促生長和增殖作用，在濃度為0.45 mg/L時(shí)可以看到細(xì)胞數(shù)量明顯增多，促增殖作用明顯[22]。

6 生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的前景展望

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞在研究起來較成體研究有很大的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)性和方便性，可以彌補(bǔ)成體缺乏等一系列的缺點(diǎn)。目前細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究。因此對所培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量就有較高的要求。各種生長因子的加入使這一要求變得簡單，近幾年越來越多的研究者置身于研究生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用，包括濃度以及培養(yǎng)時(shí)間對于所培養(yǎng)細(xì)胞的影響。對于一些不好培養(yǎng)但是又有重要研究價(jià)值的細(xì)胞系，加入生長因子無不是一種可行的方法。例如在研究一些稀缺物種時(shí)，由于數(shù)量有限采用成體作為研究對象是不可行的，只有培養(yǎng)出該物種可以傳代的細(xì)胞系，以細(xì)胞系作為研究對象，才能進(jìn)行更加深入的研究，保護(hù)物種繼續(xù)生存。同時(shí)內(nèi)源生長因子較外源生長因子也有很大的優(yōu)勢，因?yàn)閮?nèi)源生長因子是直接由培養(yǎng)的細(xì)胞來調(diào)控生成生長因子的數(shù)量和種類，更能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，避免其他不必要因素的干擾。隨著生物研究的不斷深入各學(xué)科之間的交叉也越來越多，各種不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也相繼產(chǎn)生，生長因子在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用也將不斷發(fā)展，并逐漸應(yīng)用到生物學(xué)的不同領(lǐng)域中去。

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