宮艷格,劉德夢

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所,天津 300211)

尿道致病性大腸埃希菌是引起泌尿系統(tǒng)感染常見且重要的致病菌。黏附素在介導泌尿系統(tǒng)感染過程中發(fā)揮重要作用。在目前發(fā)現(xiàn)的大腸埃希菌多種黏附素中,Afa/Dra家族黏附素中的 Dra黏附素與30%～50%膀胱炎、青年女性復發(fā)性泌尿系統(tǒng)感染密切相關,攜帶Dra黏附素的大腸埃希菌有形成慢性和復發(fā)性感染的傾向[1,2]。2008年 7月～2009年7月,我們對大腸埃希菌Afa/Dra家族黏附素進行研究,為大腸埃希菌的生物學治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 尿道致病性大腸埃希菌及受體菌來源 收集我院近 1年反復發(fā)作性泌尿系統(tǒng)感染患者尿標本中分離出的大腸埃希菌 50株,經(jīng)常規(guī)生化及血清學鑒定確定為尿道致病性大腸埃希菌。afa/draC基因陽性對照菌株AAEC191A(pCC90)由美國華盛頓大學 Steve Moseley教授惠贈,克隆受體菌 E.Coli DH5a由揚州大學畜禽病原微生物研究室朱國強教授惠贈。

1.1.2 PCR引物 afa-f:CGGCTTTTCTGCTG AACTGGCAGGC,afa-r:CCGTCAGCCCCCACGGCAG ACC[3]。引物序列由上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器及試劑 Mastercycler personal PCR儀(eppendorf公司),GELDOG-200型凝膠成像系統(tǒng)(美國B IO-RAD公司),Taq DNA聚合酶 (大連TaKaRa生物工程公司)。選擇培養(yǎng)基為在LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素 (終濃度 100 mg/ml)、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 (X-gal,終濃度 40 mg/ ml)、異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG,終濃度 24 mg/ml)制成,PCR產(chǎn)物純化試劑盒及 T(pUCm-T載體)-A克隆試劑盒(上海生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 ①煮沸法制備基因組 DNA。②PCR擴增:10×PCR buffer 2.5 ml,dNTP 250 mmol/ ml,afa-f 30 pmol/L,afa-r 30 pmol/L,Taq DNA聚合酶 0.025 U/ml,DNA模板 2 ml,去離子水 16.875 ml。PCR反應條件:預變性 94℃4 min,變性 94℃30 s,退火 53℃30 s,延伸 72℃1 min,共 30個循環(huán),延伸 72℃8 min,4℃保存。③PCR產(chǎn)物分析: 1%瓊脂糖凝膠電泳,如果出現(xiàn)明顯的 672 bp亮帶可能為陽性菌株。

1.2.2 克隆 ①感受態(tài)細胞的制備:用 0.1 mmol/ L的 CaCl2制備感受態(tài)細胞。②純化:按照 PCR產(chǎn)物純化試劑盒步驟對 PCR產(chǎn)物進行純化。③PCR產(chǎn)物與 T-載體連接反應體系:1 ml 10×Ligation Buffer,1 ml 50%PEG,1 ml pUCm-T載體,2 ml純化后的 PCR產(chǎn)物,4 ml無菌水,1 ml T4 DNA Ligase。19℃水浴過夜。④轉化受體菌 E.ColiDH5a:取 8 ml PCR產(chǎn)物與 T-載體連接混合物至新制備的 100 μl感受態(tài)細胞中,冰上放置 30 min后迅速轉移至42℃水浴 1.5 min,冰上放置 5 min,加入 400 ml LB培養(yǎng)基,37℃下 250 r/min離心 60 min。⑤篩選重組子:將恢復正常生長的轉化后細菌 4 000 r/min離心 5 min,棄上清 400 ml,利用剩余培養(yǎng)基重懸細菌后取 70 ml涂布于含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上,過夜培養(yǎng),觀察結果,白色菌落為陽性重組子,藍色菌落為陰性重組子。⑥鑒定重組子:分別將白、藍色菌落接種于含有氨芐青霉素 (100 mg/ml)的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng) 16～18 h后,用質粒提取試劑盒提取質粒,并在 2%瓊脂糖凝膠上電泳分析,觀察兩種顏色細菌質粒大小的差別,以所提取質粒為DNA模板進行 PCR擴增,并對白色菌落的質粒及其 PCR產(chǎn)物進行測序。測序結果由上海生物工程有限公司提供。

2 結果

2.1 擴增結果 有 20株菌瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)單一條帶基因片段,大小同陽性對照菌的 afa/draC基因片段大小(672 bp)相符。

2.2 克隆結果 將以上陽性菌株的 PCR產(chǎn)物分別進行 T-A克隆后篩選培養(yǎng)基上生長出藍色、白色菌落。T-A克隆所用pUCm質粒的大小為2 773 bp,克隆后質粒的大小為 3 445 bp。白色菌落和藍色菌落的質粒所在凝膠的位置分別與 3 445 bp和 2 773 bp的位置相符。

2.3 測序結果 以上述 20株 afa/draC基因片段的陽性克隆菌的質粒為模板的 PCR產(chǎn)物純化后送上海生物有限公司進行測序。與 GenBank AF329316.1的基因序列進行比對,發(fā)現(xiàn)陽性對照菌pCC90的該段基因序列與 GenBank所示完全一致; 20株臨床分離株的 afa/draC基因序列與陽性對照株 pCC90對比具有高度同源性 (大于 99%),其中分別存在 3～4處點突變,分別在第 284(2 837)、第308(2 861)、第 600(3 153)、第 620(3 173)位點。應用 Primer Premier 5軟件,將菌株 E.Coli329 afa/ draC基因片段測序所得基因序列翻譯成對應的氨基酸序列并與標準菌株 pCC90的氨基酸序列比對,結果發(fā)現(xiàn)突變位點所對應的氨基酸部分發(fā)生改變,其中第 284(2 837)位點 (G變?yōu)?T)與 第 308 (2 861)位點(T變?yōu)?C)的突變并沒有導致氨基酸序列發(fā)生改變,而第 600(3 153)位點 (T變?yōu)?C)與第 620(3 173)位點 (C變成 G)的突變則分別導致氨基酸序列第 184位絲氨酸(Ser)被脯氨酸(Pro)取代,第 206位組氨酸 (His)變成谷氨酰胺 (Gln或Q)。

3 討論

Afa/Dra家族黏附素是大腸埃希菌的主要黏附素之一,在介導大腸埃希菌與宿主細胞之間的黏附過程中發(fā)揮重要作用。攜帶Dra黏附素的大腸埃希菌對 HeLa細胞具有很強的侵襲力[4]。其特異性受體包括衰變加速因子、Ⅳ型膠原和癌胚抗原及癌胚抗原相關細胞黏附分子,該家族黏附素即通過與相應特異性受體的結合而使細菌定植于表面并由細胞的內(nèi)攝作用進入宿主細胞引起炎癥反應。該家族黏附素基因至少有 5個基因片段組成,其中 C基因長2 580 bp,編碼引導蛋白,與周漿蛋白一起輔助黏附蛋白到達細菌表面 (即周漿—伴侶途徑)。鑒于afa/draC基因片段具有高度的同源性,故該實驗針對 afa/draC基因片段設計引物,并對 PCR產(chǎn)物克隆后進行克隆子序列分析。

本試驗從 50株臨床分離的尿道致病性大腸埃希菌中篩選出 20株 afa/draC基因陽性菌,PCR擴增后進行克隆測序,測序結果顯示臨床分離菌株的afa/draC基因序列與 GenBank及陽性對照株 pCC90對比具有高度同源性,所測菌株均存在 3～4個點突變,由于該擴增片段長度 (672 bp)只占 afa/draC全基因序列長度 (2 580 bp)的 26.05%,據(jù)此推測 afa/ draC全基因序列內(nèi)可能還存在其他位點突變。本次測序菌株的該基因片段突變位點高度一致,應用Primer Premier 5軟件分析比對上述測序結果與所對應的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)突變位點所對應的氨基酸部分發(fā)生改變。

由于上述基因片斷點突變的高度一致性及所對應的氨基酸部分發(fā)生改變,推測大腸埃希菌 afa/ draC基因位點的突變極有可能由于地區(qū)差異所致的基因位點變異,這種變異可能不會影響蛋白質的結構和功能。但這一推測有待進一步研究證實。

[1]Germani Y,Béaud E,Duval P,et al.Prevalence of enteropathogenic,enteroaggregative,and diffusely adherent Escherichia coliamongisolates from children with diarrhea inNew Caledonia[J].J InfectDis,1996,174(5):1124-1126.

[2]Foxman B,ZhangL,Tallman P,et al.Virulence characteristics of Escherichia coli causing first urinary tract infection predict risk of second infection[J].J InfectDis,1995,172(6):1536-1541.

[3]Le Bouguénec C,LaliouiL,duMerle L,et al.Characterization of AfaE adhesins produced by extraintestinal and intestinal human Escherichia coli isolates:PCR assays for detection of Afa adhesins that do or do not recognize Dr blood group antigens[J].J ClinMicrobiol,2001,39(5):1738-1745.

[4]Goluszko P,NieselD,NowickiB,et al.Droperon-associated invasiveness of Escherichia coli from pregnant patientswith pyelonephritis[J].Infect I mmun,2001,69(7):4678-4680.