王建飛,鐘 理*,陳 冬,張小剛,王 皓,葛 昆,秦向東

(1河北大學(xué),河北保定 071002；2河北省第六人民醫(yī)院)

研究發(fā)現(xiàn),人類天冬氨酸鹽 β羥化酶(HAAH)是一種具有 prolyl和 lysyl羥化酶作用的依賴 α酮基的雙加氧酶,在許多人類腫瘤組織及細(xì)胞系中均呈過表達(dá)現(xiàn)象,但在食管癌中該基因表達(dá)水平的研究鮮有報(bào)道。2008年 3月 ～2009年 3月,我們采用半定量 RT-PCR技術(shù)觀察了HAAH基因在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況,探討其診斷食管癌的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇河北大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的食管癌新鮮標(biāo)本 23份,其中男 16例,女 7例；年齡 43～77歲,平均 60歲。術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療。每例樣本取癌旁組織(距離癌組織 3～5 cm),標(biāo)本獲取后立即置于 RNA Later試劑中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 HAAH mRNA檢測 采用半定量 RT-PCR。按 Trizol說明書進(jìn)行總 RNA提取,用 Oligo(dt)15及反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV進(jìn)行 cDNA的合成。所有的樣本均按照同樣的步驟操作。PCR反應(yīng)體系為25μl,其中包含:cDNA模板 1μl,上下游引物各 1μl,Taq DNA聚合酶 1 U。PCR程序:94℃預(yù)變性 5 min；PCR擴(kuò)增:94℃變性 1 min,61℃退火 1 min,72℃延伸 1.5 min,共 30個(gè)循環(huán)；最后 72℃終末延伸 10 min。PCR引物如下:目的 HAAH:5′-ATCTGTCTGGCAACGCTCA-3′,5′-ACATCGAATCTTGCAGCCT-3′,擴(kuò)增長度 442 bp；內(nèi)參 GAPDH:5′-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGGA-3′,5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′,擴(kuò)增長度 240 bp。PCR產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,利用 Quantity one軟件進(jìn)行圖像掃描及灰度值分析。將目的基因與 GAPDH的比值作為其相對表達(dá)量,進(jìn)行定量分析。繪制 ROC曲線,確定 HAAH基因表達(dá)水平的閾值。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以±s表示。根據(jù)樣本資料類型,基因表達(dá)率進(jìn)行 χ2檢驗(yàn),基因平均表達(dá)水平進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

食管癌及癌旁組織 HAAH基因表達(dá)率分為100%(23/23)、78.3%(18/23),P＞0.05。 HAAH mRNA在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平分別為 0.688±0.238、0.319±0.157,P＜0.01。經(jīng) ROC曲線分析,取 0.489作為 HAAH基因表達(dá)水平的閾值時(shí),HAAH基因在癌組織中的高表達(dá)率為 73.9%(17/23),而在癌旁組織中僅為 13%(3/23),P＜0.01。

3 討論

HAAH基因位于人類染色體 8q12.1,其開放閱讀框共有 2 277個(gè)堿基,編碼產(chǎn)物為一包含 758個(gè)氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白,也稱為 BAH。近年研究報(bào)道,HAAH基因在多種人類惡性腫瘤組織及細(xì)胞系中均呈高表達(dá)現(xiàn)象,其中包括肝癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等,而在相應(yīng)的正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。HAAH的這種過表達(dá)與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[1],移動(dòng)性增強(qiáng)[2],腫瘤的浸潤性增長[3]以及癌癥預(yù)后不良[4]等密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),HAAH基因表達(dá)水平在食管癌組織中顯著高于癌旁組織,高表達(dá)率為 73.9%。HAAH高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的浸潤性增長,而食管癌又是一種浸潤性很強(qiáng)的惡性腫瘤,因此我們推測,HAAH高表達(dá)可促進(jìn)食管癌的發(fā)展。HAAH基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種跨膜蛋白,符合免疫治療靶點(diǎn)的基本要求。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用反義寡核苷酸可以明顯抑制 HAAH在癌癥中的高表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)性[5],本研究發(fā)現(xiàn)該基因在食管癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)。分析上述,HAAH有可能成為食管癌免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

[1]Ince N,de la Monte S,Wands JR.Overexpression of human aspartyl(asparaginyl)beta-hydroxylase is associated with malignant transformation[J].Cancer Res,2000,60(5):1261-1266.

[2]Sepe PS,Lahousse SA,Gemelli B,et al.Role of the aspartyl-asparaginyl-beta hydroxylase gene in neuroblastoma cell motility[J].Lab Invest,2002,82(7):881-891.

[3]de la Monte SM,Tamaki S,Cantarini MC,et al.Aspartyl-(asparaginyl)-β-hydroxylase regulates hepatocellular carcinoma invasiveness[J].J Hepatol,2006,44(5):971-983.

[4]Luu M,Sabo E,de la Monte SM,et al.Prognostic valueof aspartyl(asparaginyl)-beta-hydroxylase/humbug expression in non-small cell lung carcinoma[J].Hum Pathol,2009,40(5):639-644.

[5]Maeda T,Sepe P,Lahousse S,et al.Antisense oligodeoxynucleotides directed against aspartyl(asparaginyl)beta-hydroxylase suppress migration of cholangiocarcinoma cells[J].J Hepatol,2003,389(5):615-622.