郁 飛,孫躍明

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,江蘇南京,210029)

膽管癌的發(fā)生是一個多基因參與的多步驟過程,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活及細胞凋亡異常等有關(guān)。膽管癌是原發(fā)于膽管上皮細胞的惡性腫瘤,起病隱襲,盡管目前有多種治療方法,預后仍較差。國內(nèi)近年來膽管癌發(fā)生率以每年5%遞增,是消化道腫瘤中上升速度最快的腫瘤。隨著蛋白組學、生物芯片和納米技術(shù)等的廣泛應用,膽管癌基礎(chǔ)研究的范圍也逐漸擴大,使得人們能夠在分子水平對膽管癌的發(fā)生、發(fā)展機制,預后進行多方面的研究?，F(xiàn)就對腫瘤標記物與膽管癌預后研究現(xiàn)狀進行做一綜述。

1 抑癌基因

1.1 p53

p53基因位于人類染色體17p13.1,是人類腫瘤研究中較為重要的腫瘤抑制基因,分為野生型和突變型。野生型p53基因是一種腫瘤抑制基因,參與細胞的分化調(diào)控,并以基因調(diào)控方式阻抑癌基因的活動,阻止異常染色體的形成。p53基因約有50%以上的突變率,突變型p53基因包括無義突變和錯義突變,突變的p53基因表達的蛋白喪失了抑癌作用,這種突變對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)有著十分重要的意義。p53基因血清學和免疫組化聯(lián)合檢測具有一定的優(yōu)勢,可以從基因角度判斷腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移并對預后進行判斷。p53抑癌基因發(fā)生無義突變時不形成突變型p53蛋白,只有錯義突變產(chǎn)生的突變型p53蛋白才能用免疫組化方法檢出,而且能產(chǎn)生相應的抗體。丁谷華、孔雷、奉典旭等[1]膽管癌組織免疫組化檢測突變型p53蛋白陽性表達為71.4%(30/42),而門靜脈血中p53抗體陽性表達52.4%(22/42),同時他們檢測了外周血p53抗體陽性3例,陽性率為7.1%(3/42),明顯低于門靜脈血途徑和腫瘤組織p53突變陽性率。Argani及其同事們[2]發(fā)現(xiàn)p53陽性組生存率有提高。而Havlik等[3]研究表明該蛋白的過度表達與預后沒有關(guān)系。p53蛋白過度表達與預后之間的關(guān)系仍有待進一步的研究。

1.2 DPC4

DPC4(Smad4)是一種抑癌基因,它編碼的蛋白調(diào)控TGFβ超家族,而 TGFβ是一個重要的細胞增殖抑制劑,DPC4的缺失被認為會加快細胞周期G1-S期的進程,從而增快了細胞的增值,轉(zhuǎn)染 DPC4基因能部分恢復對 TGFβ的反應性[4]。兩項DPC4蛋白表達的研究[2,4]表明:在肝外膽管癌腫分別有55%和60%的DPC4蛋白表達缺失,但它與生存期無相關(guān)性。肖廣發(fā)、湯恢煥[5]發(fā)現(xiàn)DPC4陽性率57.7%顯著低于對照組93.7%(P<0.05)。DPC4染色陽性與膽管癌患者年齡、性別、腫瘤部位、大小無關(guān)。DPC4染色陽性和膽管癌病理組織學類型有關(guān),乳頭狀腺癌及管狀腺癌的表達陽性率(28/35)高于黏液腺癌組(P<0.05)。DPC4的表達與膽管癌分化程度相關(guān),隨分化程度降低而減弱,高分化組與低分化組比較,有顯著性差異(P<0.01)。在高分化腺癌中DPC4表達高于中、低分化腺癌,提示膽管癌惡性程度越高,DPC4表達越低,表明DPC4在調(diào)控膽管癌的惡性程度中可能占有重要地位。神經(jīng)浸潤轉(zhuǎn)移組DPC4表達率16.7%低于無神經(jīng)浸潤轉(zhuǎn)移組者79.4%(P<0.01)。他們亦檢測了NCAM和DPC4在膽管癌及其神經(jīng)浸潤轉(zhuǎn)移中表達的關(guān)系,結(jié)果表明DPC4與NCAM表達呈負相關(guān),DPC4的低表達和NCAM的高表達預示神經(jīng)浸潤轉(zhuǎn)移的可能性較高,可能作為臨床預測膽管癌神經(jīng)轉(zhuǎn)移傾向的生物學指標。

1.3 眼癌基因

眼癌基因編碼Rb蛋白,該蛋白在非磷酸化期間阻礙了細胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)化,而這個過程是在當DNA被破壞時阻礙細胞增殖所必須的[6]。Tannapfel等[7]在51例肝內(nèi)膽管癌及Cui等[8]在34例肝外膽管癌研究中,Rb蛋白的表達和生存期無相關(guān)性。胡義利、史光軍、李占武[9]研究發(fā)現(xiàn)Rb蛋白陽性表達產(chǎn)物位于細胞核。肝門部膽管癌組Rb蛋白陽性表達率為56.5%,明顯低于膽管囊性擴張癥組90.0%(P<0.05),Rb蛋白在肝門部膽管中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05),說明Rb基因蛋白表達異常在肝門部膽管癌的發(fā)生機制中也具有重要作用。

1.4 p73基因

p73基因與p53基因有著高度的同源性,盡管在人類腫瘤中未發(fā)現(xiàn)突變的p73基因,但是過度表達的p73蛋白被認為是通過激活p53反應基因去誘導抑制細胞生長和凋亡。Tannapfel等[10]1項41例肝內(nèi)膽管癌切除標本研究發(fā)現(xiàn)32%的腫瘤過度表達p73蛋白(>10%核染色陽性),單變量分析發(fā)現(xiàn)其表達與改善生存率有關(guān),但多變量分析時無此結(jié)果。

1.5 p16基因

p16基因位于人染色體9q21區(qū),是一種細胞周期依賴性激酶4的抑制因子,p16蛋白的作用是能與CyclinD1競爭性結(jié)合CDK4,阻止細胞由G1期進入S期、抑制細胞的過度增殖,p16基因的缺失與失活見于多種惡性腫瘤。袁松林,湯輝煥[11]發(fā)現(xiàn)在膽管癌中,p16陽性表達率為7.78%(17/45),其中(+)10例(22.22%),( )7例(15.56%),在正常膽管中,p16均為陽性(100%),2者間有顯著性差異(P<0.05)。p16在Ⅱ～Ⅲ期與Ⅳ期膽管癌組間,陽性率分別為54.17%(13/24)和19.05%(4/21),其陽性表達有顯著性差異(P<0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān),表明p16陽性表達僅與膽管癌臨床分期有關(guān)。張建生、劉三光、路文彥等[12]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌組中p16為低表達,臨床早期的表達高于晚期,與組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān),認為p16低表達與膽管癌的發(fā)生及進展之間存在一定的關(guān)聯(lián)。

1.6 PTEN基因

PTEN基因是具有磷酸化作用且突變率很高的抑癌基因,具有9個外顯子可發(fā)生突變,主要發(fā)生在第5外顯子磷酸化合成酶的核心基序列以及第7、8外顯子的磷酸化酶區(qū)域。它通過抑制PI3K/Akt介導的信號傳導途徑,達到細胞周期抑制和促進凋亡的目的。PTEN還可通過抑制MAPK細胞信號傳導途徑抑制生長分化。崔平等[13]研究結(jié)果示PTEN基因總陽性表達膽管癌低于膽囊癌,差異無顯著性。不同惡性程度的膽管癌中PTEN基因表達差異無顯著性。PTEN可通過FAK的去磷酸化抑制細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤,但由于PTEN基因的突變,失去對細胞生長的負調(diào)控,導致腫瘤細胞的生長或轉(zhuǎn)移。

1.7 nm23基因

nm23基因:人類nm23基因主要有兩個亞型即nm23-H1和nm23-H2,臨床研究最多的是nm23-H1,人nm23-H1基因定位于17q21.3-22,其編碼的蛋白質(zhì)為核普二磷酸激酶(NDPK)。張炳遠等人[14]的研究表明:nm23-H1表達陽性率在膽管癌中顯著低于膽管良勝病變組織,nm23-H1表達陽性與膽管癌的臨床分期和轉(zhuǎn)移呈顯著負相關(guān),nm23-H1表達陰性的患者術(shù)后18個月復發(fā)和轉(zhuǎn)移的機會顯著增高,存活率明顯降低。他們還發(fā)現(xiàn)nm23-H1表達陽性的腫瘤組織中存在著染色強度不同的細胞群,尤其是在腫瘤邊緣向鄰近正常組織浸潤的細胞多為陰性表達這表明在同一腫瘤內(nèi)存在著侵襲力不同的多個細胞亞群,陰性的細胞系是參與浸潤和轉(zhuǎn)移的具有高侵襲潛能的細胞,對腫瘤的發(fā)展及預后起重要作用同時,也反映了nm23-H1基因?qū)δ懝馨┙櫟囊种谱饔谩?/p>

2 癌基因

2.1 k-ras

ras基因家庭包括 K-ras、H-ras和N-ras。研究表明K-ras基因點突變與膽管癌的關(guān)系密切。K-ras癌基因位于人類第12號染色體,編碼分子質(zhì)量為21000的GTP/GDP結(jié)合蛋白-p21蛋白,p21蛋白與G蛋白有關(guān),在細胞生長刺激信號的傳遞和細胞生長調(diào)節(jié)中起著一定的作用。人體細胞的K-ras原癌基因在正常情況下呈低水平表達,參與調(diào)節(jié)和維持正常細胞的功能,當受到各種因素激活后,被激活的癌基因大量表達,產(chǎn)生特異性轉(zhuǎn)化蛋白,最終導致正常細胞的癌變。盧海武等[15]膽管癌組的膽汁標本及十二指腸液標本中K-ras癌基因突變檢出率為56.7%和43.3%,而良性膽道疾病組中,除膽汁標本發(fā)現(xiàn)1例K-ras基因突變陽性外,其余病例均未發(fā)現(xiàn)變異,2組比較K-ras癌基因的突變率差異有顯著性。膽汁中K-ras基因檢出率與十二指腸液差距不大,提示十二指腸液中K-ras癌基因可能來源于膽管癌組織,獲取十二指腸液標本較簡易且無創(chuàng),所以,應用十二指腸液行分子標志物檢測對膽管癌行早期診斷的方法,臨床上有可行性,對提高膽管癌的早期診斷是有價值的。Isa等人[16]研究膽管癌中K-ras基因突變膽管癌預后沒太多的關(guān)系,但Ahrendt等[17]研究認為該突變降低了患者的生存期。

2.2 KIT

KIT(CD117)是一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶,在多種類型細胞的信號傳導通路中發(fā)揮作用。正常情況下,KIT結(jié)合其受體——干細胞因子后被激活(磷酸化),導致磷酸化級聯(lián)反應,最終在不同類型的細胞中激活各種相應轉(zhuǎn)錄因子。這種激活作用能夠調(diào)節(jié)凋亡、細胞分化、增殖、趨化以及細胞黏附。Hong和他的同事們[18]用免疫組化法檢測了289例膽管癌,發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)及細胞核KIT表達分別為19%和20%,,而細胞質(zhì)KIT陽性表達,利用單變量分析和多變量分析均發(fā)現(xiàn)與改善生存率有明顯的關(guān)系(P<0.05)。

3 凋亡調(diào)控

3.1 Bcl-2/Bax

Bcl-2蛋白家族成員,如促凋亡:Bax,Bak和BAD等,抗凋亡:Bcl-2,Bcl-w和Bcl-x1等,影響線粒體膜通透性。在這些家族成員中,Bcl-2和Bax已在膽管癌中被研究。Arora等[19]用免疫組化法對28份切除的膽管癌標本進行分析,未發(fā)現(xiàn)有bcl-2表達,但未檢測Bax表達的情況。Romani等[20]對22例肝內(nèi)膽管癌切除標本研究中,Bax表達檢出率45%,并指出Bax表達與預后無關(guān)聯(lián),但未檢測bcl-2表達情況。該文獻指出,在這些標本中,Maspin(一種多功能蛋白,通過 Bcl蛋白調(diào)控誘導凋亡)表達檢出率77%。該蛋白低表達提示腫瘤侵犯較深(P<0.05),有血管侵犯(P<0.05),多變量分析提示它是膽管癌預后較差的一個獨立影響因素。目前對Bcl-2蛋白家族成員作用的研究仍停留在單個成員的研究,聯(lián)合研究Bcl-2,Bax and Maspin表達情況或許更有意義。

3.2 DAP-kinase

死亡相關(guān)蛋白激酶(DAP-kinase)是一種新的鈣離子/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸激酶,其廣泛參與多種途徑介導的細胞凋亡,被認為是腫瘤的抑制劑,與腫瘤細胞的分化轉(zhuǎn)移有關(guān),它的表達缺失會引起細胞凋亡的降低。Tozawa等人[21]研究發(fā)現(xiàn)DAP-kinase啟動子的超甲基化,隨后的蛋白表達降低,與高等級的腫瘤有明顯相關(guān)性(P<0.05),降低了總生存率(P<0.05),是一個獨立的預后標記物(P<0.05)。

4 糖類標記物

CA199是一種高分子糖蛋白,抗原決定簇為含唾液酸的神經(jīng)結(jié)甙酯,膽管癌患者中血清CA199升高的敏感性、特異性分別為 88.15%,92%(>37 U/mL),對膽管癌患者的診斷有較高價值,且血清CA199在監(jiān)測術(shù)后復發(fā)中也具價值。陳漪等[22]研究顯示血清CA199濃度升高與肝內(nèi)膽管癌患者預后顯著相關(guān)。Jan等[23]以及李方華等人[24]研究顯示血清CEA和CA199均為肝內(nèi)膽管癌獨立預后因素,同時李方華等研究顯示TBIL為肝內(nèi)膽管癌獨立預后因素,他們認為將術(shù)前CEA,CA199,TBIL濃度聯(lián)合作為判斷肝內(nèi)膽管癌患者預后的預測因子,可能起到更好的預測作用。Wahab和他的同事們[25]運用單變量及多變量分析發(fā)現(xiàn)膽管癌切除術(shù)后CA199的升高與患者預后差有相關(guān)性。但CA199表達依賴于Lewis抗原及其分泌基因的表達,人群中約7%的人 Lewis抗原陰性,這部分人查不到CA199;另一方面,在膽石癥、膽道感染患者中CA199也可升高,因此對這部分患者在臨床診斷中應予注意。

5 蛋白類標記物

5.1 CEA

CEA是一種分子量為18 000 Da的酸性糖蛋白、胚胎期合成于消化系統(tǒng),出生后其濃度下降,來源于內(nèi)胚層。是由腫瘤組織產(chǎn)生的、具有人類胚胎抗原特異決定簇的酸性蛋白。Hirohashi等[26]研究35例肝內(nèi)膽管癌標本,運用單變量及多變量分析發(fā)現(xiàn)CEA高水平與膽管癌預后差有相關(guān)性(P<0.05)。而Miwa等[27]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌患者術(shù)前CEA水平與預后無明顯相關(guān)性。

5.2 CRP

CRP是一種肝臟合成種肝臟合成的急性反應性蛋白,主要功能是調(diào)理炎癥部位的反應和對抗創(chuàng)傷及感染部位釋放的溶蛋白酶的有害作用等。在各種感染性疾病的急性期以及風濕性疾病和惡性腫瘤患者血清中CRP值均有升高,研究表明它與許多惡性腫瘤的預后有相關(guān)性。Gerhardt等[28]在1項98例肝門部膽管癌研究中,發(fā)現(xiàn)CRP的升高是膽管癌低生存率的一項獨立判斷指標。

6 其他標記物

6.1 MUC5AC

黏液素是一種高度糖基化的糖蛋白,由黏液素分泌細胞分泌,分布在上皮組織表面,起到潤滑和保護上皮細胞的作用,膽道黏膜上皮持續(xù)表達MUC3、MUC6和MUC5B,MUC5AC在正常膽道黏膜上皮尚未發(fā)現(xiàn)表達,而在膽管癌細胞中可檢測到MUC5AC表達,Boonla等[29]對179名組織學上確診為膽管癌的患者進行隨訪,發(fā)現(xiàn)血清MUC5AC黏液素陽性的膽管癌患者,中位生存時間127 d,而血清MUC5AC黏液素陰性的膽管癌患者,其中位生存時間329 d(P<0.001)。多變量分析顯示:血清MUC5AC黏液素陽性的膽管癌患者死亡危險性較陰性患者高2.5倍。

6.2 MMP7

異常分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶使得腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移,Miwa等[30]用免疫印跡法檢測26例膽管癌MMP7表達,分析其與臨床病理特征和預后的關(guān)系,推測膽管癌中MMP7高表達者惡性程度高,預后不良。

6.3 RCAS1

RCAS1是一種40kD的Ⅱ型膜蛋白。Suzuoki等[31]檢測60例肝外膽管癌標本顯示:RCAS1在肝外膽管癌所有階段均可表達 ,其陽性率86.7%(52/60),RCAS1表達與膽管癌臨床病理特征間沒有顯著性聯(lián)系 ,其高表達是一個獨立的不良預后因素。

7 結(jié) 語

隨著蛋白組學、生物芯片和納米技術(shù)等的廣泛應用,膽管癌預后標記物取得一定進展,雖顯示有臨床應用價值,但其應用前景尚有爭議。目前面臨的問題就是如何進一步證實和篩選這些指標,評價其作為膽管癌預后指標的價值,正確組合應用有效的預后標記物。這一問題的解決將有助于膽管癌患者手術(shù)方式的選擇,術(shù)后綜合治療及個體化治療,提高膽管癌患者生存率。

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