朱建波 趙銘山

(1.山東省濱州市人民醫(yī)院,山東濱州 256603;2.濱州醫(yī)學院,山東濱州 256603)

支氣管哮喘是由多種炎癥細胞,包括嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)、肥大細胞、淋巴細胞、上皮細胞等多種細胞及其細胞組分參與的慢性氣道炎癥,其中EOS起著尤為關(guān)鍵的作用[1-2]。骨髓釋放EOS向肺組織內(nèi)趨化、黏附及EOS凋亡障礙是哮喘EOS增多的主要機制。聚集活化的EOS不但可以分泌多種炎性物質(zhì)破壞氣道黏膜,影響肺臟正常的生理功能,而且活化的EOS能夠合成、分泌轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2),參與氣道重塑;通過表達過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR gamma)抑制氣道的免疫反應[3]。

長效 β2受體激動劑(long-actingβ2-agonist,LABA)因其起效快、作用時間長而倍受臨床醫(yī)師青睞。沙美特羅和福莫特羅(formoterol,FMT)是LABA的代表藥物,然而近年來有報道[4]β2受體激動劑在體外能夠抑制EOS凋亡,可能加重氣道炎癥。而糖皮質(zhì)激素能夠抑制EOS向肺內(nèi)遷移,快速誘導外周血中EOS及組織中EOS凋亡;能夠減少肺組織中嗜酸性粒細胞趨化活化因子(eotaxin)的表達,抑制包括嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)的釋放,已被證實為抑制哮喘氣道EOS炎癥方面最有效的藥物。本實驗通過復制哮喘大鼠模型,以地塞米松為對照,研究福莫特羅在體內(nèi)對EOS浸潤氣道的作用,為臨床治療哮喘提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠(SPF級,購于山東大學實驗動物中心)。

1.2 實驗試劑和實驗儀器 富馬酸福莫特羅(沈陽山之內(nèi)制藥有限公司生產(chǎn));地塞米松磷酸鈉注射液(濟南利民制藥有限責任公司生產(chǎn));卵蛋白(Ⅲ級)(Sigma公司提供,編號A5378);大鼠 eotaxin酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn));大鼠ECP酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海軒昊科技有限公司生產(chǎn));原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)、DAB顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1.3 實驗方法

1.3.1 哮喘模型的制備及給藥方法 48只雄性Wistar大鼠,鼠齡 6～ 8周,體質(zhì)量 180～220 g,隨機分為6組,每組8只。A組為正常對照組;B組為哮喘模型組;C組為小劑量福莫特羅組(0.08 mg?kg-1);D中等劑量福莫特羅組(0.12 mg?kg-1);E組為大劑量福莫特羅組(0.16 mg?kg-1);F組為地塞米松組(0.5 mg?kg-1)。模型復制參照文獻[5]并加以改進,正常對照組給予等量的0.9%氯化鈉液(NS)對照操作。各實驗組第1、8天注射卵蛋白(albumin,OVA)混懸液(OVA 1 mg,0.9%氯化鈉液1 mL,氫氧化鋁 200 mg,四肢內(nèi)側(cè)皮下、腹腔內(nèi)各注射0.2 mL)。第15天起將大鼠放入自制密閉容器內(nèi),2%卵蛋白混懸液霧化吸入30 min,大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、點頭呼吸、打噴嚏、煩躁不安、大小便失禁等過敏反應癥狀。對照組給予0.9%氯化鈉液霧化吸入相同時間。按照以上方法每天霧化吸入1次,連用10 d。

給藥方法:從第18天(即第4次誘發(fā)哮喘日)開始,每次誘發(fā)前1 h,激素組給予地塞米松腹腔注射,0.9%氯化鈉液灌胃;福莫特羅組給予相應劑量的0.9%氯化鈉液腹腔注射,福莫特羅灌胃;對照組分別給予0.9%氯化鈉液腹腔注射,0.9%氯化鈉液灌胃。連用7 d。

1.3.2 取材及標本制備 最后1次誘發(fā)哮喘后48 h(中性粒細胞＜1%,淋巴細胞＜9%),2%戊巴比妥鈉(46 mg?kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,將其仰面固定在解剖臺上,打開腹腔,從腹主動脈抽血5～10 mL,剪斷腹主動脈。打開胸腔,剪開左心耳,充分放血。切取右肺,稱體質(zhì)量后-80℃凍存。左肺切成厚度約4 mm組織塊,4%多聚甲醛固定。切取右側(cè)肺組織,稱質(zhì)量后-80℃冰凍30 min。30 min后將冰凍肺組織放入勻漿器內(nèi),加入少量冰0.9%氯化鈉液(0.5 mL?g-1,以 20 000 r?min-1離心 10 min將組織攪碎。勻漿液以3 000 r?min-1離心10 min,留取上清液-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｇ腥∽髠?cè)肺組織,4%多聚甲醛內(nèi)固定4～5 h,經(jīng)過水洗、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋。采用連續(xù)切片的方法行HE染色及原位凋亡測定,觀察組織炎癥變化、EOS浸潤及凋亡情況。

1.3.3 嗜酸性粒細胞趨化活化因子(eotaxin)及ECP測定 用酶聯(lián)免疫吸附的方法測定(按照說明書操作)。

1.3.4 EOS凋亡率的測定 用原位凋亡的方法(TUNEL)測定肺組織切片中凋亡的 EOS(按照說明書操作)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理。實驗數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示。各組數(shù)據(jù)均行正態(tài)檢驗(Q-Q圖)和方差齊性檢驗(Levene法)。各指標比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗;指標間相關(guān)比較采用Pearson相關(guān)分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理改變 HE染色的EOS在鏡下表現(xiàn)為胞漿呈鮮紅色,細胞核為桿狀或呈分葉狀。正常大鼠肺組織中EOS數(shù)量少,哮喘組肺組織內(nèi)有大量EOS浸潤,福莫特羅組浸潤EOS數(shù)量明顯減少,并且隨福莫特羅劑量增加,EOS數(shù)量遞減。糖皮質(zhì)激素組多種炎癥細胞減少(圖1)。

2.2 各組大鼠肺組織切片EOS原位凋亡(圖2);各組大鼠肺組織中浸潤EOS數(shù)量及其凋亡指數(shù)(表

1) 蘇木素復染后的組織切片中凋亡細胞的細胞核為棕黃色。每張切片由同一名觀察者在高倍鏡(×400)下隨機選擇10個視野,分別計算支氣管、血管周圍EOS浸潤的數(shù)量及凋亡指數(shù)(凋亡細胞占相應EOS的百分比),平均值作為該片的代表值。哮喘模型組可見大量未凋亡的EOS,凋亡明顯延遲,凋亡指數(shù)下降;福莫特羅組EOS凋亡抑制,凋亡指數(shù)降低;地塞米松組EOS凋亡延遲幾乎能夠完全糾正,凋亡指數(shù)提高。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變(HE染色×400)

圖2 各組大鼠肺組織原位凋亡圖(蘇木素復染×400)

A.正常對照組 氣管周圍浸潤炎癥細胞較少,但凋亡細胞較多,其中可見分葉核的EOS,亦可見凋亡的上皮細胞,淋巴細胞。B.哮喘模型組氣管周圍可見大量的炎癥細胞浸潤,主要為EOS和淋巴細胞。凋亡的EOS為分葉或桿狀核,而凋亡的淋巴細胞核多為圓形,胞核均黃染。C.小劑量福莫特羅組 氣管周圍浸潤EOS較哮喘模型組減少,凋亡細胞比例也有所減少。D.中等劑量福莫特羅組氣管周圍浸潤EOS較小劑量福莫特羅組減少,凋亡細胞的比例也降低。E.大劑量福莫特羅組氣管周圍浸潤EOS減少,凋亡細胞的比例進一步下降。F.地塞米松組氣管周圍浸潤炎癥細胞較少,但是凋亡細胞較多,可見凋亡的EOS和淋巴細胞。

2.3 各組大鼠肺組織勻漿中eotaxin及ECP的含量(表2),福莫特羅干預下浸潤EOS數(shù)量與eotaxin直線相關(guān)分析 哮喘大鼠肺組織中eotaxin及ECP的含量明顯增加,而福莫特羅各組含量明顯減少;肺組織中EOS浸潤數(shù)量與eotaxin的含量呈直線正相關(guān)(圖3)。

表1 各組大鼠肺組織中浸潤EOS數(shù)量及其凋亡指數(shù)(ˉx±s)

表2 各組大鼠肺組織勻漿中eotaxin及ECP的含量(ˉx±s)

圖3 福莫特羅干預下EOS數(shù)量與eotaxin含量相關(guān)分析

3 討 論

哮喘的本質(zhì)是氣道炎癥,多種炎癥細胞長期浸潤氣道是支氣管哮喘的一個突出特征。對基因缺失(如表達IL-5,IL-4的基因)大鼠模型的研究[6]表明了EOS在哮喘病理改變和氣道高反應性中的重要作用。無論是哮喘的急性發(fā)作期還是緩解期,氣道內(nèi)都有大量的EOS浸潤,對氣道造成持續(xù)性破壞,這被認為是哮喘經(jīng)久不愈,慢性遷延的原因之一,而減少肺內(nèi)EOS的浸潤則促進哮喘氣道炎癥的消退。

本實驗結(jié)果顯示福莫特羅組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡指數(shù)下降,說明福莫特羅在體內(nèi)能夠抑制EOS凋亡,但福莫特羅抑制EOS凋亡的作用無明顯的劑量依賴性。Machida等[4]在體外發(fā)現(xiàn)福莫特羅抑制EOS凋亡的作用隨濃度增高范圍內(nèi)逐漸增強。體內(nèi)實驗尚需增加福莫特羅劑量差距,觀察其抑制作用是否具有劑量依賴性。

除了EOS凋亡障礙,骨髓釋放的EOS向肺組織內(nèi)趨化、黏附也是影響哮喘EOS增多的機制,為此我們做了相應的研究。影響EOS向肺組織內(nèi)遷移的主要細胞因子是IL-5和eotaxin,有研究[7]表明福莫特羅不能通過IL-5影響EOS在肺組織內(nèi)的浸潤,而可能通過影響eotaxin的表達來影響EOS的浸潤。eotaxin是由呼吸道上皮細胞、平滑肌、纖維母細胞及多種炎癥細胞,如淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞和EOS等分泌的,屬于C-C化學性趨化因子超家族中的β亞群。本實驗發(fā)現(xiàn)福莫特羅能減少肺組織勻漿中eotaxin的含量,且福莫特羅干預后氣道中浸潤的EOS數(shù)量與肺組織勻漿中eotaxin呈直線正相關(guān),說明福莫特羅可能通過抑制eotaxin的表達減少肺組織內(nèi)浸潤的EOS數(shù)量。體外實驗有研究表明福莫特羅能夠通過抑制平滑肌細胞組蛋白H4乙酰化從而抑制eotaxin基因轉(zhuǎn)錄減少其表達。

活化的EOS能夠分泌多種毒性蛋白,痰液中的ECP較血清中的含量更能反映患者病情的嚴重程度,是抗炎療效的觀測指標之一。本實驗測定了肺組織勻漿中ECP的含量,結(jié)果證明福莫特羅能夠減少肺組織內(nèi)ECP的含量。一些研究表明在體外福莫特羅能夠通過抑制血小板或纖維母細胞等多種途徑抑制EOS的活化,減少炎癥介質(zhì)的釋放,推測在體內(nèi)亦有相同的作用。盡管本實驗觀察到ECP含量降低了,但是尚不能排除EOS數(shù)量變化對ECP含量的影響。

盡管福莫特羅抑制EOS的凋亡,但是本研究結(jié)果表明肺組織內(nèi)EOS的數(shù)量是減少的,與哮喘模型組有顯著性差異。因此我們認為福莫特羅對EOS數(shù)量的影響主要是通過eotaxin發(fā)揮作用的而不是抑制細胞凋亡,至少在短期內(nèi)是這樣的。Wallin等[8]對輕度哮喘患者的研究表明,吸入福莫特羅24μg,每天2次,2個月后氣管黏膜下EOS明顯較對照組減少。但有研究[9]得出相反的結(jié)論,長期規(guī)律應用β2受體激動劑患者氣道中EOS數(shù)量增加,但是否與抑制EOS凋亡有關(guān),尚缺乏證據(jù),畢竟影響EOS數(shù)量的因素很多。近年來的研究表明在過敏原的刺激下,肺組織中也有CD34+細胞存在。Sergejeva等[10]研究哮喘豚鼠肺泡灌洗液中分離的CD34+細胞,發(fā)現(xiàn)氣道中的CD34+細胞能夠表達IL-5R,不但能夠分化為成熟的EOS,而且自身有增殖的能力,提示CD34+細胞與IL-5R+細胞的分化增殖也可能是哮喘肺組織EOS浸潤的一個重要來源。

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8 Wallin AT,Cioppa GD,Holgate S,et al.The effects of regular inhaled formoterol and budesonide on preformed Th-2 cy tokines in mild asthmatics[J].Respir Med,2002,96(12):1021-1025.

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10 Sergejeva S,Johansson AK,Malmhall C,et al.Allergen exposure-induced differences in CD34+cell phenotype:relationship to eosinophilopoietic responses in different compartments[J].Blood,2004,103(4):1270-1277.