武多嬌 周曉鷗 高平進(jìn) 朱鼎良

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心,上海 200032;2.上海市高血壓研究所,上海 200025)

基因芯片技術(shù)是將大量探針固化于固相支持物上,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過對雜交信號的檢測分析,得出樣品的遺傳信息。該技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、快速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),在科研領(lǐng)域、生物制藥和醫(yī)學(xué)診斷上都具有良好的應(yīng)用前景[1-2]。在疾病診斷方面,由于大部分疾病與多基因有關(guān),利用DNA芯片可以快速尋找多個(gè)基因和位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性,從而為研制相應(yīng)的藥物和提出新的治療方法提供依據(jù)。

嗜鉻細(xì)胞瘤是由腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞及交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成的腫瘤,瘤組織持續(xù)或間斷地釋放大量兒茶酚胺引起持續(xù)性或陣發(fā)性高血壓和多個(gè)器官功能及代謝紊亂。嗜鉻細(xì)胞瘤患者中約10%為孟德爾遺傳疾病患者,如多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤?、蛐?mutiple endocrine neoplasia type II,MEN II)[3]等。這些家族性嗜鉻細(xì)胞瘤呈常染色體顯性遺傳[4],目前已知嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生與4種基因有關(guān),它們是 RET原癌基因、VHL基因、SDHD基因和SDHB基因。目前國內(nèi)外對于嗜鉻細(xì)胞瘤患者的基因測試普遍采用DNA直接測序技術(shù)。然而,這些疾病的已知致病突變多達(dá)100多個(gè),散布在4個(gè)基因,如全部測序?qū)⒑馁M(fèi)大量人力物力。本研究設(shè)計(jì)開發(fā)一種低通量的基因芯片對嗜鉻細(xì)胞瘤的基因突變進(jìn)行識別和診斷,并通過與測序結(jié)果比較來評價(jià)此芯片的準(zhǔn)確性,為臨床大規(guī)模應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片設(shè)計(jì)和點(diǎn)樣 根據(jù)文獻(xiàn)[5]選擇與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的 4個(gè)基因(RET、VHL、SDHB和SDHD)共87個(gè)突變位點(diǎn)。檢測位點(diǎn)全部位于基因外顯子區(qū)域,涵蓋與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的85%的已知變異位點(diǎn)。根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,將探針用點(diǎn)樣液稀釋成50μmol?L-1,用GMS 417點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣至經(jīng)特殊處理過的玻片上。芯片的質(zhì)量控制包括陽性對照和陰性對照。點(diǎn)好的芯片經(jīng)水合30 min、0.2%十二烷基硫酸鈉及雙蒸水分別洗脫10 min、干燥等過程完成芯片的制備。

1.2 樣本DNA的制備 取患者外周血5 mL,用酚-氯仿方法提取DNA。嗜鉻細(xì)胞瘤患者(6例)來自上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院高血壓病科。另有29例經(jīng)基因測序已確定突變位點(diǎn)的DNA樣本由法國巴黎蓬皮杜醫(yī)院遺傳中心主任Jeunemaitre教授饋贈(Department of Genetics,H?pital Européen Georges Pompidou,Paris,France)。所有病例結(jié)合臨床癥狀、生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查、外科手術(shù)及病理切片檢查確診為嗜鉻細(xì)胞瘤。本研究所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 樣本擴(kuò)增 PCR反應(yīng)標(biāo)本的擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL混合體系:25 ng DNA樣本,1μmol?L-1引物,200μmol?L-1dNTPs,1.0 mmol?L-1Mg2+,1.5μL DMSO,0.8 g?L-1BSA 和 2.5 U Taq聚合酶在1×Taq聚合酶緩沖體系(Takara,日本)。PCR程序:94 ℃5 min預(yù)變性、94 ℃30 S、50℃30 S、72℃45 S,40個(gè)循環(huán);72℃5 min(MJ Research PTC-200;MJ Research,美國)。

1.4 雜交反應(yīng) 雜交步驟如下:將PCR擴(kuò)增液和陰性、陽性擴(kuò)增液加入到同一個(gè)薄壁管中,98℃熱變性5 min,取出后迅速放入冰盒,在-20℃環(huán)境中放置5 min。然后取出基因芯片,做好樣品編號,在雜交艙中加入預(yù)雜交液后在42℃環(huán)境中靜置5 min,吸除該緩沖液;吸取雜交緩沖液與已變性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合物混勻,將液體全部加入到雜交艙中,42℃雜交30 min。吸除雜交艙中溶液后清洗2次。

1.5 顯色反應(yīng) 檢測探針采用生物素標(biāo)記,堿性磷酸酶(AP)催化的NBT/BCIP顯色反應(yīng)。在雜交艙中加入抗體溶液,室溫放置20 min;吸除雜交艙中溶液,清洗2次;向雜交艙中加入顯色液溶液,42℃避光放置40 min。吸除雜交艙中溶液,小心揭除雜交艙,用蒸餾水沖洗后,置42℃烘干;將顯色載玻片面朝下置于BaiO生物芯片識讀儀片槽上檢測。

1.6 檢測分析 圖像經(jīng)Array Doctor軟件分析可自動輸出檢測結(jié)果。各個(gè)信號值均經(jīng)過背景信號值的校正。芯片中1個(gè)檢測位點(diǎn)由相鄰的3個(gè)雜交點(diǎn)組成,計(jì)算3個(gè)雜交點(diǎn)的均值為該檢測位點(diǎn)的信號值,然后將野生型與突變型位點(diǎn)的信號值進(jìn)行比較以判斷是否存在位點(diǎn)突變。

2 結(jié) 果

2.1 芯片雜交質(zhì)量控制 芯片的掃描結(jié)果顯示,陽性參照有明顯的雜交信號,信號強(qiáng)度基本一致,說明芯片雜交、掃描等步驟正常,該陽性參照的雜交信號可作為內(nèi)對照進(jìn)行校正(即進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理)。陰性參照無信號檢出,說明無非特異性雜交。

2.2 芯片雜交和基因測序結(jié)果比較 用于芯片檢測的35例DNA樣本均來自散發(fā)確診的嗜鉻細(xì)胞瘤患者。以基因測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),其中29例DNA樣本經(jīng)基因測序已明確存在1個(gè)突變位點(diǎn),另外6例DNA樣本經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)突變。芯片檢測結(jié)果顯示91%的樣本芯片雜交與基因測序結(jié)果一致。尤其是這兩種方法對SDHD和RET基因突變位點(diǎn)的檢測符合率為100%(表1,圖1)。另外在6例測序證實(shí)無突變的樣本中,芯片檢測結(jié)果同樣為陰性。因此,芯片雜交和基因測序的結(jié)果十分一致。但是有3例樣本經(jīng)芯片檢測與基因測序比較仍存在差異(表1)。其中2例測序得到的SDHB基因突變位點(diǎn)(外顯子 6,密碼子 198,核酸 591del C)和(外顯子7,密碼子23,核酸CGC→TGC)芯片未能檢出;另外有1例VHL基因突變位點(diǎn)(外顯子3,密碼子167,核酸499 CGG→TGG),芯片雜交顯示較弱信號,強(qiáng)度僅為野生型信號值的30%,無法將其判斷為特異性雜交,提示雜交條件仍需改進(jìn)。

表1 基因芯片和基因測序的結(jié)果比較

圖1 基因芯片雜交圖圖1為芯片雜交圖,左側(cè)為對照,右側(cè)為陽性標(biāo)本雜交結(jié)果。右側(cè)中左邊紅框內(nèi)是RET基因的野生型(外顯子11,密碼子634,核酸TGC),右邊紅框內(nèi)為該位點(diǎn)突變型(外顯子 11,密碼子 634,核酸TGC→GGC突變)。

3 討 論

一些方法,例如傳統(tǒng)的基因序列分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性毛細(xì)血管電泳(DCE)和變性高效液相層析(d HPLC)均可用于檢測基因突變,但這些技術(shù)都各有相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn),例如費(fèi)用高、耗時(shí)及檢測量和可檢測突變類型的有限制等[6-7]。相比而言,基因芯片通過雜交反應(yīng)檢測嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)基因突變較快速、簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用,適用于臨床大量樣本的基因篩查和測試。

本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的基因芯片用于檢測嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的4個(gè)基因(RET、VHL、SDHB和 SDHD)共計(jì)87個(gè)突變位點(diǎn),這些位點(diǎn)全部位于外顯子區(qū)域,涵蓋與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的85%的變異位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)共驗(yàn)證4個(gè)基因29個(gè)突變位點(diǎn),檢測結(jié)果證實(shí)芯片雜交和基因測序的結(jié)果一致,尤其是在對于SDHD和RET基因突變位點(diǎn)的檢測中2種方法符合率為100%。在6例無突變的樣本中,芯片與測序結(jié)果一致。

對本芯片研究我們獲得以下體會:在引物探針設(shè)計(jì)方面,MgCl2濃度的改變對聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)效果的影響較大,擴(kuò)增片斷較短雜交效果好,以后的實(shí)驗(yàn)應(yīng)把擴(kuò)增片斷控制在200 bp以內(nèi),位點(diǎn)離生物素標(biāo)記的引物3'端不宜太近,否則由于擴(kuò)增片斷,產(chǎn)生空間位阻而影響雜交。并且部分探針間隔臂的長度由16變?yōu)?0,比增加探針長度效果好,特別是當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測位點(diǎn)附近序列的二級結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜時(shí),用這種方法比較好。

本實(shí)驗(yàn)的基因芯片雖然顯示出良好的識別突變位點(diǎn)的效能,但在個(gè)別樣本中也顯示其不足之處。由于未收集到所有基因突變類型樣本,用合成的寡核苷酸驗(yàn)證樣本的突變探針,然而合成的寡核甘酸探針與真實(shí)DNA擴(kuò)增片斷在長度和結(jié)構(gòu)上存在一定的差別,它并不能完全模擬真實(shí)DNA擴(kuò)增片斷與固定在芯片上的特性探針的雜交反應(yīng),所以不能保證在以后的應(yīng)用中能準(zhǔn)確檢測出預(yù)實(shí)驗(yàn)中沒有的基因型。因此本芯片投入實(shí)際應(yīng)用前,尚需要更多樣本的驗(yàn)證。

DNA芯片的高密度信息量和平行處理的優(yōu)點(diǎn)不僅使多基因分析成為可能,而且保證了診斷的高效、廉價(jià)、快速和簡便。本研究開發(fā)的基因突變檢測芯片經(jīng)過現(xiàn)有標(biāo)本的檢驗(yàn),具有識別嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)基因突變的良好功能,在嗜鉻細(xì)胞瘤的基因診斷中可望具有良好的應(yīng)用前景。

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