摘要:從公園的花土中分離出一株相對高產(chǎn)堿性果膠酶的菌株，經(jīng)16srDNA鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為TCCCC11286。在初步的酶學性質(zhì)研究中表明，它耐高溫耐堿，最適作用溫度為45℃，到60℃仍有酶活，最適作用pH為8.0。經(jīng)過培養(yǎng)基的初步優(yōu)化，菌株TCCCC11286對于富含銨根離子的化學物質(zhì)和淀粉具有很好的利用能力。本實驗還對酶的分離純化進行了初步研究。

關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌 優(yōu)化 分離純化

Abstract:A bacterial strainrelativilyhighly producingalkalinepectate lyasewasobtained from the soil of variaseflowersin the Park.The bacteriumwas primarily identifiedasastrainthat belongs to Bacillus sp.based on 16s r DNAand it was named as TCCCC11286.Study on the characteristics of alkalinepectinaseshowedthatit was high temperature resistant and alkali proof.The highestactivityoftheenzymewas at pH8.0 and 45℃，even moreit was more activity at 60℃.Under the optional fermentation conditions，strain TCCCC11286 could make good useofcornstarch and chemical substances full ofNH4+.Furthermore，we preliminarily seperated and purified the pectinase.

Keyword:Bacillus sp. optimization separation and purification.

果膠酶(pectinases)是一類能分解植物組織中果膠質(zhì)(由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物)的酶系，按底物專一性、對糖苷鍵作用機理、切斷方式等，大致可分9種組分。堿性果膠酶是指在堿性范圍內(nèi)具有較高活性的果膠酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase，PGL) [1]。果膠酶廣泛應用于食品工業(yè)的果汁加工，果酒澄清，飲用酶制劑，生物農(nóng)藥，而堿性果膠酶除在植物病毒的純化、紙漿漂白等方面得到應用外，已成為綿織物處理過程中至關(guān)重要的生物制劑。用果膠酶可以用于不能進行堿精練的織物(如綿和羊毛混紡織物)處理 [2]，而且處理后的織物損傷小，織物柔軟豐滿，對環(huán)境的污染少，操作人員的工作環(huán)境和設(shè)備的腐蝕情況均比堿精練好[3-6]。

自1972年日本學者Koki Horikoshi首次用嗜堿細菌制得堿性果膠酶以來 [7]，至今已分離鑒定出幾十種堿性果膠酶，但其中能應用于工業(yè)化生產(chǎn)的不多，僅Novo Nordisk公司在1999年研制出用基因工程菌生產(chǎn)的堿性果膠酶Bio-Prep，以及于2003年推出的一種堿性果膠裂解酶ScourzymeL，但高昂的生產(chǎn)成本限制了其廣泛應用 [8]。因此，如何提高、提純PGL的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本是其開發(fā)應用的關(guān)鍵。本實驗針對從土壤中分離得的一株相對酶活較高的菌株，進行優(yōu)化、提純方面的研究，為進一步應用于工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1.材料和方法

1.1菌種

枯草芽孢桿菌TCCC11286，這是本實驗中心菌種庫的編號，篩選編號為521

1.2試劑

Polygalacturonic acidBeijing Biodee Biotechnology

十六烷基三甲基溴化銨北京奧博星生物技術(shù)有限任公司

果膠天門峽富達果膠工業(yè)有限公司

聚乙二醇天津天泰精細化學品有限公司T.T.R.C

甘氨酸天津市珠江衛(wèi)生材料廠

無水葡萄糖國藥集團化學試劑有限公司

可溶性淀粉天津市四通化工廠

酵母粉OXOID LTD，BASINGSTOKE，HAMPSIRE，ENGLAND

TPYPTONEOXOID LTD.，BASINGSTOKE，HAMPSIRE，ENGLAND

AgarJapan

磷酸天津市北方天醫(yī)化學試劑廠

NaOH天津市北方天醫(yī)化學試劑廠

(NH4)2SO4天津市風船化學試劑科技有限公司

1.3培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20、酵母粉10、NaCl 20于121℃下滅菌20min

(2)種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖20、蛋白胨10、玉米漿30、MgSO4 1、 K2HPO4 18.4、KH2PO4 6、pH=7于121℃下滅菌20min

(3)發(fā)酵液(g/L):乳糖20、蛋白胨3、CaCl2 3、果膠20、酵母膏3、MgCl2 0.2、pH=7.0~7.5于121℃下滅菌20min

(4)篩選培養(yǎng)基(g/L):果膠5、酵母膏5、蛋白胨5、MgSO4 2、K2HPO4 1、瓊脂20、pH=7.0~7.5于121℃下滅菌20min

(5)斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、蛋白胨5、牛肉膏5、NaCl 5、瓊脂條20、pH=7.0于121℃下滅菌20min

(6)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):果膠20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0于121℃下滅菌0min

(7)測生長曲線用無機鹽種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖20、(NH4)2 SO4 40、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO4 4、KH2PO4 0.3、pH=6.5～7.0于121℃下滅菌20min

(8)測生長曲線用無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖40、(NH4)2SO4 40、MgSO4·7H2O 0.4、K2HPO4-KH2PO4 0.05mol/L、FeSO4 0.2 pH=6.5～7.0于121℃下滅菌20min

1.4篩選方法

1.4.1富集培養(yǎng)

將從公園中采集到的月季、馬蘭、竹、美人蕉、菊、迎春、松的培養(yǎng)土分別稱取5g土樣溶于45ml去離子水中，吸取5ml菌懸液加入到45ml(用250ml錐形瓶配制，121℃滅菌20min)的富集培養(yǎng)基中，作搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)24h。

1.4.2初篩

將富集培養(yǎng)的樣品稀釋分離后涂布在篩選培養(yǎng)基中，放入37℃倒置培養(yǎng)24h觀察，并在平板倒入少量(1%)十六烷基三甲溴化銨，靜置10min觀察并測量菌落周圍出現(xiàn)透明圈的直徑(d/cm)和菌落直徑(d/cm)，有透明圈者則為有果膠酶活性的菌株。將產(chǎn)果膠酶的菌種接種于斜面培養(yǎng)基貯藏于4℃下。

1.4.3復篩

將初篩得到的51株菌接種到斜面，37℃，培養(yǎng)24h后，接種到搖瓶進行一級發(fā)酵，200r/min，24h后對發(fā)酵液進行酶活測定。

1.5培養(yǎng)方法

再挑取單菌落接入種子培養(yǎng)液中。(種子培養(yǎng)液按25ml/250ml的量于錐形瓶中分裝，并單獨滅菌)，作搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，在37℃下培養(yǎng)24h。然后種子液按8%的接菌量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，(發(fā)酵培養(yǎng)基按50ml/500ml的量分裝于500ml的錐形瓶中，并單獨滅菌)，作搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，在37℃下培養(yǎng)24h后測酶活。

1.6菌種鑒定

1.6.1菌體形態(tài)特征

將菌種接種于平板LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后，用雙目生物顯微鏡在油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.6.2菌落形態(tài)特征

將菌種接種于平板LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后，按常規(guī)方法觀察菌落形態(tài)。

1.6.3生理生化鑒定

按照伯杰氏細菌鑒定手冊方法進行

1.6.416SrDNA測序鑒定

這部分工作由天津科技大學生物工程學院菌種鑒定中心完成

1.7堿性果膠酶酶活測定方法

取20μl發(fā)酵液稀釋酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)，45℃反應15min，用3ml0.03 mol/L的磷酸溶液終止酶反應，在235nm處測定其吸光值。

一個標準酶活單位(1U)定義為:每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)為4600L/mol·cm[9].

1.8酶液的分離純化

1.8.1果膠酶粗酶液的制備

分別挑一環(huán)521菌接種于2個250ml錐形瓶中，每瓶分裝25ml種子培養(yǎng)基(滅菌)，作37℃搖床培養(yǎng)，200r/min，培養(yǎng)24h后，以8%的接菌量接入10個500ml錐形瓶中，每瓶分裝50ml優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中(滅菌)，作37℃搖床培養(yǎng)，200r/min，培養(yǎng)24h后，于4000r/min，4℃下離心10min，取上清液。分別測定其酶活力和蛋白含量。

1.8.2硫酸銨梯度鹽析提純

將以上酶液中酶活力在0.3～0.8μg/ml的錐形瓶中的酶液混合得310ml酶液。取70ml的酶液分裝于7個250ml的錐形瓶中，以如下的比例濃度加入硫酸銨沉淀過夜。

分別將7個瓶中的酶液在4000r/min，4℃下離心10min，分別收集上清液測酶活力及蛋白含量;將每個樣的離心后的沉淀溶于等體積的PH9.0的甘氨酸-NaOH-CaCl2緩沖溶液中，測定酶活力和蛋白含量，并與相對應的酶液的酶活力作對照。取分離效果顯著的濃度作為其余240ml酶液處理的最適濃度，并分別測定上清與沉淀的酶活力與蛋白含量。

1.8.3透析和濃縮

將上清液分裝于透析袋中靜置于去離子水中，4℃下透析過夜，然后，取出透析袋，在周圍灑上分子量為20000的PEG，靜置于4℃下濃縮過夜。

1.8.4 Sephadex G-75柱層析

20×1000mm的玻璃柱裝好Sephadex G-75萄聚糖凝膠，先用0.02mol/L PH 8.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液平衡，上樣，以0.02mol/L pH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速30ml/h，收集各組分，用于酶活和蛋白含量測定

2.結(jié)果和討論

2.1菌體形態(tài)特征

521枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征:單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，無鞭毛。最適生長溫度為37℃，在保藏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)10h后菌體呈桿狀。產(chǎn)芽孢，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5(μm)，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體膨大。

2.2菌落形態(tài)特征

菌株521的菌落呈不規(guī)則形，由無色變淡粉紅再時間長變?yōu)楹谏D狀，光滑，不透明，邊緣較整齊。

2.3 16SrDNA測序鑒定

經(jīng)16SrDNA測序鑒定521菌株為枯草芽孢桿菌

2.4堿性果膠酶的一般酶學性質(zhì)研究

2.4.1生長曲線和產(chǎn)酶曲線

521菌株的純無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生長情況及產(chǎn)酶情況如下圖3-2所示?？梢钥闯?，521菌在5h～18h為對數(shù)生長期，菌量生長快速。同時在11h～17h時開始大量產(chǎn)酶，并在13h和17h出現(xiàn)兩個明顯的酶活峰，以13h出現(xiàn)的酶活峰為最高。表明果膠酶出現(xiàn)在細胞代謝和生長旺盛時期，與細胞生長增殖有關(guān)。因而加大菌體含量可大大提高酶活力。

2.4.2堿性果膠酶的動力學曲線

酶反應動力學常數(shù)Km和Kcat可表達酶反應性質(zhì)、反應條件和酶反應速度之間的關(guān)系。對于特定的反應、特定的反應條件來說，米氏常數(shù)Km(Michaelis constant)是一個特征常數(shù)，米氏常數(shù)(Michaelis constant)(Km)它的意義如下:它的數(shù)值等于酶促反應達到其最大速度Vm一半時的底物濃度[S]，單位為mol/L。它可以表示酶和底物之間的親和能力，Km值越大，親和能力越弱，反之亦然。其中Km值最小的那個反應的底物就是酶的最適底物。Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)而與酶的濃度無關(guān)，與底物的濃度也無關(guān)，這一點與Vm是不同的，因此，我們可以通過Km值來鑒別酶的種類。但是它會隨著反應條件(T、pH)的改變而改變。競爭性抑制劑米氏常數(shù)不變，最大反應速度減小;反競爭性抑制劑米氏常數(shù)減小，最大反應速度減小。

影響酶促動力學常數(shù)的主要有以下五點:底物濃度，酶的量，pH值，溫度，抑制劑和激活劑。

底物濃度:主要應由酶的Km值決定。當[S]>>Km，反應成0級反應;當[S]<10Km，速度達到理論最大反應速度的91%;當[S]過小時，一是底物溶液的配制不好掌握，二是反應速度太小;一般酶的Km值多在10-5~10-3mol/L，所以[S]應在0.05~5mmol/L之間。而且隨著[S]的增大，反應速度也應逐漸增大。

酶的濃度:酶的濃度越大，反應速度越快。酶的濃度太大，會導致反應速度太快，吸光度無法測量;酶的濃度太小，又會導致反應速度太慢，時間掃描時形成的時間-吸光度曲線趨于平緩，效果不明顯。所以，酶濃度應控制在使反應在3~5min內(nèi)到平衡的范圍內(nèi)，一般在10-12~10-7mol/L之間。

圖中的橫軸截距為-Km，縱軸截距為Km/Vmax，斜率為1/Vmax，求得

Km=0.4123(g/L)

Vmax=0.252(g/s)

即當果膠酶的酶促反應速度達到最大速度的一半時(0.127g/s)時，底物濃度為0.4123g/L。

2.4.3 pH對果膠酶酶活力的影響

2.4.3.1堿性果膠酶最適作用pH的確定

pH通過改變酶和底物分子解離狀態(tài)影響反應速率，酶催化活性最高時反應體系pH稱為酶促反應的最適pH。如圖2-4所示，最適作用pH是8.0。

2.4.3.2堿性果膠酶的pH穩(wěn)定性

從圖2-5可以看出，當酶液在不同pH緩沖液范圍內(nèi)耐受30min后，堿性果膠酶在pH8.0～12均具有酶活性。在pH9.5時酶活達到最高，最高耐受范圍在pH12，從圖的整體趨勢可以看出，果膠酶中聚半乳糖醛酸裂解酶的堿性穩(wěn)定范圍在pH9.5～12。這種特性很適合工業(yè)生產(chǎn)中耐堿性的條件。

2.4.4溫度對堿性果膠酶酶活力的影響

2.4.4.1堿性果膠棧酶的最適作用溫度

溫度對果膠酶的酶促反應速率具有雙重影響。當溫度下降時，酶活力也呈下降趨勢，當溫度升高時酶活力又呈上升趨勢，但當溫度太高時，則由于酶蛋白的熱變性而會使酶活降低，所以，酶促反應的最適溫度就是這兩種作用綜合的結(jié)果，即使酶促反應速率表現(xiàn)最快時反應體系的溫度。如圖2-6所示，果膠酶的最適作用溫度為45℃。

2.4.4.2果膠酶酶促反應的溫度穩(wěn)定性

如圖2-7所示，酶促反應在45℃作用30min時，具有最大酶活，隨著溫度的升高酶活呈下降的趨勢，在65℃還具有酶活性;

2.4.5金屬對堿性果膠酶酶活力的影響

將等體積的酶液與濃度為1mmol/L的Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+溶液混合，充分作用30min，然后測定酶活。以空白水為對照，結(jié)果如表2-8所示，Ca2+和Cu2+具有明顯的激活作用，Mg2+對酶促反應沒有影響作用，而Co2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、K+、Ba2+對酶具有抑制作用。

2.4.6碳源種類對產(chǎn)酶的影響

碳源一菌體合成自身骨架的主要物質(zhì)來源，是影響菌體生長和代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素。本實驗以原始發(fā)酵培養(yǎng)基中乳糖、果膠、酵母膏為碳源作為對照，分別取總碳摩爾數(shù)相同(以10g/L的葡萄糖為基準)的豆餅粉+玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果膠、淀粉+果膠作為替換的碳源，對照相對比活率。結(jié)果如圖2-9，521菌對于豆餅粉+玉米粉的利用率比較高，酶活相對提高50%，同時對淀粉+果膠的利用率也比較高，酶活相對提高了44%。考慮到，在實際工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉+果膠的水溶解度均比豆餅粉+玉米粉要好，而且成本低，因而成為優(yōu)化培養(yǎng)基的首選。

2.4.7氮源種類對產(chǎn)酶的影響

氮源是菌體合成自身蛋白和遺傳物質(zhì)的主要來源，也是代謝產(chǎn)物中氮元素的來源之一。本實驗以原始發(fā)酵培養(yǎng)基中以蛋白胨為氮源作為對照，分別稱取總氮摩爾數(shù)相同(以10g/L為基準)的酵母浸粉、尿素、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉作為替換的氮源，對照相對比活率。結(jié)果如圖2-10，521菌對于硫酸銨的利用最好，相對酶活提高了8%。說明521菌對于無機NH4+具有高利用率，可以考慮在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中使用富含銨根離子的物質(zhì)。

通過不同離子、碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響結(jié)果，確定521菌的優(yōu)化培養(yǎng)基為(g/L):果膠20、淀粉20、NH4NO3 15、MgCl2 0.2、MgSO4 2、CaCl2 3、K2HPO4 4、pH=8.0。在這個優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，經(jīng)過發(fā)酵，以8%的接種量，250ml三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，在37℃，200r/min回轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)24h后測酶活達到28μ/ml，比目前國內(nèi)報道的最高酶活34U/ml略低，但比原始酶活提高了30%。

2.5酶的分離純化

2.5.1果膠酶粗酶液的制備、鹽析

用優(yōu)化培養(yǎng)基作為521菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵后獲得的粗酶液首先用硫酸銨鹽析。由于中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此謂鹽溶;當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO42-和NH4+)有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。在一般文獻報道中，大多分離純化蛋白酶均使用50%～70%的硫酸銨，本實驗采用30%的硫酸銨鹽析，結(jié)果收集的上清液中，提純總收率達到了141。

2.5.2 Sephadex G-75柱層析

粗酶液在經(jīng)過鹽析、透析和濃縮后，經(jīng)過SephadexG-75柱層析，進一步除鹽，并根據(jù)組分中蛋白分子量大小的不同，依次洗脫，從而分離蛋白組分。以時間為橫坐標，以收集的每管液體的酶活為縱坐標，繪出其洗脫曲線如圖2-11。

可以看出，在洗脫曲線中，在20min和100min處明顯有兩個酶活峰，均具有聚半乳糖醛酸裂解酶。

最后酶液的分離提純結(jié)果如下表2-1所示。

3.結(jié)論

本研究從公園的不同花土中分離得到一株相對高產(chǎn)堿性果膠酶的產(chǎn)生菌并進行了鑒定，鑒定為枯草芽孢桿菌，編號為TCCCC11286。

菌株TCCCC11286所產(chǎn)堿性果膠酶的溫度穩(wěn)定性在45℃～60℃，最適作用溫度為45℃，PH穩(wěn)定性為9.5～12，最適作用PH為8.0，這些耐高溫和耐堿性的特點很適合在實際紡織工業(yè)中堿性環(huán)境下處理織物的特點，因而具有很好的開發(fā)前景。

通過產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化，該菌株的產(chǎn)酶能力相對提高30%。從氮源和碳源的考察中可知，菌株TCCCC11286對于銨根離子和淀粉的利用能力較強，可以考慮在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中使用廉價的富含銨根離子的化學物質(zhì)和低成本的淀粉。

在菌株TCCCC11286所產(chǎn)堿性果膠酶的分離純化中，本實驗采用了30%的硫酸銨鹽析、SephadexG-75柱層析等方法，由于酶液中含雜離子濃度小，得到很好的純化分離酶的效果。這種處理方式在實際生產(chǎn)中由于所需鹽量少，也節(jié)約了酶提純的成本。本實驗的方法為進一步開發(fā)工業(yè)用菌提供了很好的理論和數(shù)據(jù)依據(jù)。

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作者單位:河北省廊坊市大廠高級實驗中學