郭建生，陳士偉

(1、空軍杭州航空醫(yī)學鑒定訓練中心，浙江 杭州 310007；2、長海醫(yī)院實驗診斷科，上海 200433)

1993 年Lee等[1]利用遺傳分析的方法在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個22個核苷酸的小分子非編碼RNA-lin-4開始，microRNA(miRNA)被帶入了研究領(lǐng)域，但直到最近幾年這類基因的多樣性和廣泛性才被揭示出來。一系列的研究表明，microRNA在機體正常發(fā)育、分化、生長及凋亡中發(fā)揮重要的作用，如胚胎發(fā)育、細胞生長和凋亡、血細胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和脂肪代謝等，隨著研究的進展，對miRNA的研究從量的表象變化已經(jīng)慢慢過渡到作用機制，進入了更深一步的研究。隨著檢測方法的進步，一個新的領(lǐng)域—循環(huán)miRNA也逐漸成為科研的熱點，成為潛在的檢測標志物和治療靶向點。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系，本文對此進行部分闡述。

1 miRNA概述

miRNA(miRNA)是一類有大約1923個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，在細胞增殖、分化、凋亡、個體發(fā)育、病毒感染及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的生物學功能。它們由細胞核內(nèi)基因組DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，經(jīng)過特異性核酸酶drosha第一次切割形成pre-microRNA，利用運輸?shù)鞍?5到達胞漿后再經(jīng)過Dicer酶的第二次切割而得到成熟miRNA，其通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到達 mRNA，與靶基因 3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)完全或部分互補結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA翻譯抑制并參與RNA干擾反應(yīng)，使相應(yīng)基因表達水平下降[2]。miRNA與靶mRNA完全互補配對后，mRNA被降解，若miRNA與靶mRNA不完全互補，則起到封閉靶mRNA的作用，抑制其翻譯過程[3]。編碼miRNA的基因占全部預(yù)測基因的1～5%，每種miRNA可調(diào)控多種靶基因，一個靶基因可能受不同miRNA的調(diào)控，改變?nèi)祟惖鞍谆虻谋磉_，維持機體的功能[4]。

2 miRNA與疾病

2.1 miRNA與腫瘤

miRNA表達與腫瘤的相關(guān)性是最有吸引力的研究。提取腫瘤組織細胞的RNA，利用microarray分析發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織與周圍的正常組織相比較miRNA表達水平有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，發(fā)生miRNA圖譜改變，這一現(xiàn)象初步肯定了腫瘤發(fā)生與miRNA表達之間具有一定的相關(guān)性。已經(jīng)有大量文獻報道疾病中有關(guān)的組織或細胞miRNA圖譜發(fā)生變化，特別是腫瘤miRNA表達譜可以提示其組織來源，同時也證明miRNA表達譜有助于人類腫瘤的組織分型，而且miRNA表達譜在提示組織譜系方面比傳統(tǒng)的miRNA表達譜效果更好。此外，miRNA表達譜還可以為低分化腫瘤找到其組織來源[5]。

miRNA既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性，也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。Calin GA等[6]首次驗證了microRNA在某些類型的白血病和淋巴瘤中發(fā)生了功能障礙，其中miR-15和miR-16起著關(guān)鍵作用，這兩種miRNA通過抑制Bcl-2蛋白的表達調(diào)節(jié)細胞凋亡過程，Bcl-2蛋白主要通過作用于線粒體來實現(xiàn)其抑制凋亡的生物學活性，因此當miR-15和miR-16丟失或突變時，Bcl-2蛋白的表達量上調(diào)，細胞凋亡受阻，因而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。作為癌基因的miR-21，研究證明在膠質(zhì)母細胞瘤中表達升高，同時乳腺癌樣品中表達也有增加，故認為miR-21可能在腫瘤發(fā)生中起到廣泛的作用。而人的肺癌細胞中瞬時的表達let-7，作為抑癌基因，可以抑制細胞的增殖，如果肺癌患者的let-7表達降低，患者預(yù)后更差，非小細胞肺癌患者的let-7表達水平越低，其預(yù)后越差，術(shù)后生存期越短。同時最近研究也發(fā)現(xiàn)miR-31抑制抑癌基因促進肺癌的發(fā)生，它作用的目標基因是抑癌基因Last2(large tumor suppressor 2)和Ppp2r2a(PP2A regulatory subunit B alpha isoform)，與它們結(jié)合后促進腫瘤的生成，抑制抑癌基因發(fā)揮抑癌作用，人工敲除miR-31，Lats2和Ppp2r2a表達明顯上升，肺癌病人和肺癌鼠的miR-31和目標mRNA的表達相反，充分證實了這個結(jié)論[7]。

2.2 miRNA與內(nèi)分泌疾病

在我國內(nèi)分泌疾病有很大的人群，從功能上說主要表現(xiàn)為兩種情況，一是功能亢進，二是功能減退，雖然發(fā)病緩慢，但對病人造成的痛苦不可小覷。miRNA的出現(xiàn)為內(nèi)分泌疾病的診斷和治療帶來了新的思路和方法。從胰腺B細胞分泌、胰島素的作用等每個環(huán)節(jié)都有miRNA的參與，而且影響其它相關(guān)分子。對來自1型糖尿病和正常人的Treg細胞進行miRNA篩查，利用TaqMan arry分析發(fā)現(xiàn)與正常人相比1型糖尿病病人Treg細胞miR-510上升近100倍，而miR-342和miR-191下降為近2倍和3倍。雖然具體的作用機制還沒有明確，但圖譜的改變已經(jīng)說明miRNA在1型糖尿病中的重要作用[8]。

雌激素受體(ERα)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，由荷爾蒙、DNA、和轉(zhuǎn)錄活化因子幾個重要結(jié)合區(qū)域組成，miR-22與表達ERα的mRNA的3’端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合強力抑制ERα產(chǎn)生，過表達的miR-21通過誘導(dǎo)mRNA的降解而使ERα產(chǎn)生減少使雌激素的作用減弱，因而可以從另一方面思考miR-21的過表達可以抑制雌激素依賴性乳腺癌細胞的生長[9]。MiR-18已經(jīng)被證實作用于編碼ERα的基因ESR1，過表達MiR-18降低ERα水平但同時促進肝癌細胞 (HCC)的增殖，對女性肝癌病人來說miR-18的過表達阻礙了雌激素潛在的保護作用而促進了肝癌的發(fā)展[10]。

2.3 miRNA與自身免疫性疾病

已經(jīng)證實miRNA在免疫調(diào)節(jié)和免疫細胞發(fā)育扮演了重要角色。到目前為止，已經(jīng)揭示一群特異性的miRNA在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。利用LPS對人monocytic THP-1細胞進行刺激發(fā)現(xiàn)miR-146、miR-155和miR-132上調(diào)，TNF-a和IL-1b可以誘導(dǎo)miR-146的表達。進一步的分析揭示這是NFkB依賴性的[11]。由IFN-b和多種TLR配體的作用，鼠巨噬細胞miR-155表達上升，這些說明miR-155參與細菌和病毒的先天性免疫。而LPS刺激鼠巨噬細胞會引起miR-125的下調(diào)，因此推斷miR-125可能作用于TNF-amRNA，在LPS誘導(dǎo)TNF-a產(chǎn)生時miR-155表達下調(diào)[12]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫性疾病，產(chǎn)生多種自身物質(zhì)的抗體包括染色質(zhì)、核糖和磷脂等而且臨床表現(xiàn)多樣。Dai等利用microarry分析來自23名SLE患者和10名健康者的外周血單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA的表達，結(jié)果得出7種 miRNAs(miR-196a，miR-17-5p，miR-409-3p，miR-141，miR-383，miR-112，and miR-184) 表達下調(diào)，9 種 miRNAs(miR-189，miR-61，miR-78，miR-21，miR-142-3p，miR-342，miR-299-3p，miR-198，andmiR-298)表達下調(diào)[13]。對狼瘡腎炎活檢組織的miRNA的圖譜分析也有改變，36種上調(diào)和30種下調(diào)[14]。這些資料表明對于SLE患者miRNA可作為潛在診斷標志物和疾病相關(guān)分析因子。

2.4 miRNA與其它

皮膚是人體分布最廣的器官，在表皮和毛囊中的一些miRNA的高表達是皮膚正常發(fā)育必不可少的，將鼠胚胎皮膚祖細胞Dicer敲除發(fā)現(xiàn)皮膚上皮不能產(chǎn)生成熟miRNA，毛胚芽進入表皮層而不是正常的到真皮層。正常毛囊分化關(guān)鍵信號分子(sonic hedgehog，Shh 和 Notch homolog 1，Notch1)的表達在出生后7d消失[15]。MiR-203與皮膚形成有關(guān)，胚胎發(fā)育至13.5～15.5d時，鼠基底層細胞相比基底細胞miR-203增高25倍，miR-203抑制p63的表達，p63是表皮細胞增殖和分化的重要因子[16]，在胚胎形成中p63基因啟動上皮形成，維持表皮基底層成熟角質(zhì)細胞的增殖潛力。皮膚microRNA的改變會引起增殖、分化的錯誤信號，最終導(dǎo)致皮膚疾病的產(chǎn)生。

3 循環(huán)miRNA

3.1 循環(huán)miRNA的來源與檢測方法

對于循環(huán)miRNA的來源目前主要觀點有：循環(huán)RNA來自于凋亡或壞死的細胞，細胞的主動釋放，以及循環(huán)細胞的裂解.但對于特定循環(huán)miRNA的真實來源還存在許多未知的因素。研究表明，內(nèi)源性的循環(huán)RNA分子具有良好的抗RNase降解能力，有較高的穩(wěn)定性。雖然目前機制還不是很清楚，但并不影響對其的研究。為了驗證內(nèi)源性miRNAs在血漿中的穩(wěn)定性，Mitchell等[17]將血漿放置室溫24h或經(jīng)過8次凍融對目的基因的量進行測試發(fā)現(xiàn)影響很小，沒有顯著差異，充分證實了miRNA在血漿中的穩(wěn)定性，具備作為臨床檢測指標的條件之一。

目前對microRNA的檢測主要有兩種方法，一是利用microarray芯片，對基因進行篩查，二是利用real-time PCR對目的基因進行相對定量檢測，有Taqman探針和SYBgreen法，Taqman探針因其具有特異、敏感和快速優(yōu)于SYBgreen法而逐步成為實驗方法的金標準。由于在血清中miRNA的含量少且其分子量小，因而在進行樣本抽提時不同于普通的RNA抽提。利用mirVana PARIS試劑盒，用等體積酸性酚-氯仿抽提樣品以去除蛋白成分，通過不同梯度100%乙醇的加入達到對不同RNA成分的分離最終獲得高濃度的miRNA洗脫液用于下面的逆轉(zhuǎn)錄和定量檢測。

3.2 循環(huán)miRNA是檢測的潛在標志物

與組織表達的miRNA一樣，循環(huán)miRNAs首先最廣泛地用于對腫瘤疾病的研究。在血清中檢測腫瘤組織中高表達miRNA并對其分析來判斷miRNA對疾病診斷、治療、預(yù)后的檢測作用。循環(huán)miR-1可作為急性心肌梗死 (acutemyocardial infraction，AMI)的潛在標記物，與正常組比較AMI在疾病組的Ct值中值有明顯的差別(CtI=32.11，AMI=28.35)，利用ROC 曲線(receiver–operator characteristic curve，ROC)分析來肯定它的診斷價值，并且回歸分析miR-1的水平與年齡、性別、高血壓、糖尿病等與AMI有關(guān)的因素都無相關(guān)[18]。miRNA還可用來對懷孕不同時段的監(jiān)測，與未孕對照組比較孕期第一階段(6～12周)和孕期第三階段(34～41周)let-7d、miR-527、miR-520d5p、miR-526a、miR-141 的表達隨著孕齡增加而增高，對胎兒發(fā)育起到監(jiān)測的作用[19]。

4 展望

通過miRNA檢測達到對疾病的檢測、治療和預(yù)后的檢測已經(jīng)是目前關(guān)于RNA研究的熱點，miRNA的表達有高度保守性、時序性和組織特異性，而且在血清或血漿中通過實驗方法可以檢測量的表達變化。雖然大部分miRNA的功能和作用機制還沒有完全清楚，但其在維持機體健康和疾病監(jiān)控的作用越來越受到關(guān)注。目前蛋白水平檢測是在轉(zhuǎn)錄翻譯后，而miRNA則通過影響轉(zhuǎn)錄后翻譯達到調(diào)控，對疾病的臨床意義更大，并且就當前的技術(shù)可以很快地建立起miRNA為系統(tǒng)的檢測方法，以miRNA為新的檢測標志物的建立是可以期盼的。

[1]Lee RC,Feinbaum RI,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementaritv to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[2]Zarnore PD,Haley B,Ribo-gnome.The big world of smallRNAs[J].Science,2005,309(5740):1519-1524.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:Genomics,Biogenesis,Mechanism and Function[J].Cell,2004,116(2):281–297.

[4]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosimes,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[5]Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancer[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

[6]Calin GA,Dumitru CD,Shimizu M,et al.Frequent deletions and downregulation ofmicro-RNA genesmiR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):15524-15529.

[7]Liu X,sempere LF,Ouyang H,et al.MicroRNA-31 functions as an oncogenic microRNA in mouse and human lung cancer cell by repressing specific tumor suppressor[J].JClin Invest,2010:120(4):1298-1309.

[8]Hezova R,Slaby O,Faltejskova P,et al.MicroRNA-342,microRNA-191 and microRNA-510 are differentially expressed in T regulatory cells of type 1 diabetic patients[J].Cell Immunol,2010,260(2):70-74.

[9]Pandey DP,Picard D.miR-22 inhibits estrogen signaling by directly targeting the estrogen receptor alpha mRNA[J].Mol Cell Biol,2009,29(13):3783–3790.

[10]Liu WH,Yeh SH,Lu CC,et al.MicroRNA-18a prevents estrogen receptor-alpha expression,promoting proliferation of hepatocellular carcinoma cells[J].Gastroenterology,2009,136(2):683–693.

[11]Perry MM,Moschos SA,Williams AE,et al.Rapid changes in microRNA-146a expression negatively regulate the IL-1beta-induced inflammatory response in human lung alveolar epithelial cells[J].J Immunol 2008,180(8):5689–5698.

[12]Tili E,Michaille JJ,Cimino A,et al.Modulation ofmiR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNFalpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock[J].JImmunol 2007,179(8):5082–5089.

[13]Dai Y,Huang YS,Tang M,et al.Microarray analysis ofmicroRNA expression in peripheral blood cells of systemic lupus erythematosus patients[J].Lupus,2007,16(12):939–946.

[14]Dai Y,SuiW,Lan H,et al.Comprehensive analysis ofmicroRNA expression patterns in renal biopsies of lupus nephritis patients[J].Rheumatol Int,2009,29(7):749-754.

[15]Andl T,Murchison EP,Liu F,et al.ThemiRNA-processing enzyme dicer is essential for the morphogenesis and maintenance of hair follicles[J].Curr Biol,2006,16(10):1041–1049.

[16]Yi R,Poy MN,Stoffel M,et al.A skin microRNA promotes differentiation by repressing ＇ stemness＇[J].Nature,2008,452(7184):225–229.

[17]Mitchell PS,Parkin PK,Kroh EM,et al.CirculatingmicroRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[18]Ai J,Zhang R,Li Y,et al.CirculatingmicroRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,391(1):73–77.

[19]Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoSONE,2008,3(9):3148.