張正平,孫 勇,張正慧,孫啟峰

(1.山東省萊蕪市高莊醫(yī)院,山東萊蕪 271100;2.山東省萊蕪市人民醫(yī)院,山東萊蕪 271100;3.山東省萊蕪市牛泉醫(yī)院,山東萊蕪 271100)

腫瘤的化療是其綜合治療的一個重要方面,而多藥耐藥(MDR)的影響是導致化療失敗的重要原因。國內外對逆轉MDR也進行了很多研究工作,在各種引起MDR的機制中,以P糖蛋白(PgP)介導的 MDR占重要方面,針對逆轉PgP介導的MDR的研究也較多,主要包括化學逆轉劑、單克隆抗體和基因水平調控等方面,本文是對PgP介導的 MDR的逆轉的研究進展做一個簡要綜述。

所謂MDR系指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時,對其他許多結構不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物亦產生交叉抗藥性,它是一種獨特的廣譜耐藥現(xiàn)象[1],PgP是一種ATP依賴性的跨膜外流泵,可將細胞內化療藥物排出細胞外,從而導致腫瘤細胞內化療藥物的蓄積濃度降低而不能有效殺死腫瘤細胞,從而導致腫瘤細胞耐藥。幾乎所有人類腫瘤細胞均有不同程度的PgP表達,但是對化療不敏感或療效差的腫瘤往往有較高的PgP表達水平[2],目前對PgP介導的MDR的逆轉的研究主要從以下幾個方面進行。

1 化學逆轉劑

1.1 鈣離子通道阻滯劑和鈣調素抑制劑：鈣離子通道阻滯劑是最早發(fā)現(xiàn)具有逆轉MDR作用的藥物,主要有Verapamil(VER)及其衍生物、雙氫吡啶類化合物以及硫氮卓酮等。研究表明,鈣離子通道阻滯劑在 mdrl基因的翻譯水平上抑制Pgp的合成及活性,增加腫瘤細胞內的化療藥物濃度,克服腫瘤細胞的耐藥性,提高化療效果。但由于這些藥物對心血管系統(tǒng)有 -定毒性,所以限制了它們在臨床上的應用。Micktsch等報告在 VER的衍生物中 R-ver和 nor-VER具有鈣離子通道阻滯作用很小,同時又具有較低的細胞毒性和較高的逆轉能力的特性,故 R-ver和 nor-VER最有希望用于臨床。具有MDR逆轉作用的鈣調素抑制劑主要包括三氟拉嗦、三氟丙嗦、氯丙嗦、氟奮乃靜等吩噻嗪類化合物,其作用機制與鈣離子通道阻滯劑相似。

1.2 免疫抑制劑環(huán)孢霉素 A(Cs A)及其類似物：無免疫抑制作用的 CsA衍生物 SDZ PSC833在體內外均能夠逆轉MDR 1基因的表達,阻止MDR克隆的形成,國外已將該藥用于難治性白血病和實體瘤的臨床研究[3,4];還有報道環(huán)孢霉素A及其衍生物 PSC 833可以明顯改變抗腫瘤藥物的藥代動力學,使血藥水平提高、減慢藥物的體內代謝[5],而PSC833的逆轉作用是環(huán)孢霉素 A的 5～10倍,且無環(huán)孢霉素A的免疫抑制作用和腎毒性,目前已進人臨床試驗。

1.3 抗激素類化合物：雌激素非完全拮抗劑三苯氧胺(Tamoxifen)作為 MDR逆轉劑已用于臨床。Kirk等在對 5種新的抗雌激素衍生物的逆轉耐藥效果的研究中發(fā)現(xiàn),雌激素完全拮抗劑ICⅡ64的逆轉效果更好,它使阿霉素和長春新堿對MDR細胞 MCF-7/adr的毒性分別增加 25,35倍。ICⅡ64能完全逆轉轉染了 mdrl基因的肺癌細胞 Sl/1.1對長春新堿的耐藥,阻斷 Pgp對長春新堿的泵出?？乖型衔?RU486是孕酮化合物的衍生物。RU 486在低濃度((1μmol/L)時就可以有效抑制小鼠 Pgp的泵出功能,增加化療藥物蓄積,對人的 Pgp也有同樣的效果。有人認為,RU486結構中的 1位(β-dimethylaminophenyl)取代基對于其拮抗劑Pgp功能發(fā)揮起到了重要作用,可見類固醇衍生物也是一類可以抑制Pgp泵出的逆轉劑。

1.4 蛋白激酶抑制劑：蛋白激酶(PKC)可以改變藥物在MDR細胞中的蓄積,在一些 MDR的腫瘤細胞 P KC的活性增加,推測抑制 P KC的活性可以對抗 MDR的發(fā)生。CGP41251是高度選擇性的PKC抑制劑,具有抗腫瘤作用及有效的耐藥逆轉作用,它可使 3種 MDR細胞系對阿霉素和長春新堿的敏感性增加。Pgp是一個 ATP依賴的“藥泵”,CGP41251可能是直接與 Pgp競爭 ATP或通過競爭 Pgp上的藥物結合位點,從而阻斷了Pgp的泵出功能,達到逆轉耐藥的作用.目前,對 CGP41251逆轉機制尚不清楚,需進一步研究。KT-5720是另 -具有逆轉MDR的蛋白激酶抑制劑,在非毒性的濃度下可有效增加耐藥細胞 KB-V1、HU-1對化療藥物的敏感性,其抗耐藥機制尚不清楚。

1.5 表面活性劑：表面活性劑如吐溫 80,gremophorEL以及solutol HS15等被證明可以逆轉 MDR,CRL1337是一種ethoxylated oleicacid制劑,它比 solutol和 gremophor表現(xiàn)出更高的耐藥逆轉活性。

1.6 多芳基取代咪唑類化合物：阮繼武等人用設計并合成了幾個新的多芳基取代咪唑類化合物(I一V),并選擇了兩種腫瘤耐藥細胞株KBV和 M CF-7/adr,采用MTT法測定了其對由 P-gP介導的MDR的逆轉效果.結果表明,化合物II和III具有很好的體外逆轉 M DR活性(已申請專利保護[6]。

1.7 其他：除上面幾種主要的逆轉劑以外,5-溴甲苯[7],FK 506以及其結構類似物Rapamycin,新的哇琳化合物MS-209,精胺聚合物 Poly-SPM.(polymeric conjugate of spermine),十字花科蔬菜中富含的代謝產物Indole-Carbinol(13 C),還有一些化合物也具有MDR的逆轉作用。

2 單克隆抗體

單克隆抗體是采用耐藥細胞或耐藥細胞膜蛋白作為抗原而制備的,可特異性識別、結合Pgp的胞膜外部分,從而逆轉 MDR 1表型。將藥物與單抗相連,借助抗原-抗體的生物特異識別機制,可實現(xiàn)藥物的主動靶向。脂質體表面交聯(lián)單克隆抗體制成的免疫脂質體可滿足多種實際需要.抗 PgP的單抗能夠抑制MDR細胞對PgP底物的外排,增加PgP運輸藥物的細胞毒性。實驗證明,CD19的單克隆抗體可以抑止CD19和 PgP的相互作用,可導致淋巴瘤的 MDR逆轉[8]。單克隆抗體FC-2.15能夠識別腫瘤細胞膜表面的糖類抗原表面決定簇,并能夠連接白細胞表面糖蛋白,然后通過補體介導的細胞毒性作用溶解細胞。FC-2.15可在補體的作用下明顯提高人類乳腺癌細胞對阿霉素和紫杉醇的敏感性[9]。應用 PgP的單克隆抗體MRK-16可以封閉 PgP的離子通道,從而阻止細胞化療藥物的外流,充分發(fā)揮化療藥物細胞毒性作用。在小細胞肺癌的動物模型實驗中,應用 MRK-16單克隆抗體可以抑制SCID大鼠細胞的耐藥性和遠處轉移,同時提高大鼠的生存率[10]。這可能因為抗體不僅可以直接針對原位腫瘤細胞的PgP產生抗性,而且可以進入血液循環(huán)對轉移的腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒性作用。

3 基因水平調控

近年來,國內外開始將反義技術應用于腫瘤耐藥性逆轉的研究。根據(jù)堿基互補原理,設計出能特異地同相應靶基因結合的RNA或DNA,影響靶基因的轉錄和翻譯,以達到特異抑制靶基因表達的基因調控技術,包括反義 RNA(AntisenseRNA)技術,反義 DNA(Antisense DNA)技術,又稱反義寡核苷酸(Antisense oligodoxynucleotide,ASODN)技術、核酶(Ribozyme)技術。

3.1 MDR1基因的反義寡核苷酸(ODN)：MDR 1基因為一個較小的基因家族,雖然其轉錄調節(jié)過程尚不十分清楚,但已有研究證實其轉錄調節(jié)部位在MDRl基因 5'端上游非編碼區(qū)內,設計這段反義基因,發(fā)現(xiàn)能使耐藥的腫瘤細胞得到逆轉。李惠芳等利用互補于MDR 1基因5'末端轉錄起始部位的ODN直接轉染表達MDR 1基因的耐藥細胞株KB-8-5后,細胞內 Pgp表達水平下降,為弱陽性,細胞內柔紅霉素(DNR)濃度提高,被轉染細胞對藥物的LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 3.2倍。以上結果說明 ODN逆轉了PgP介導的藥物耐受性,但逆轉作用不完全.作者分析其原因之一為ODN的降解問題.為此,作者以脂質體 Lipofectin作為轉基因載體,使 ODN的耐藥逆轉作用有所提高,被轉染細胞對DNR的 LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 2.5倍,提示脂質體可作為引導 ODN靶向治療的方式之一,另有作者則認為對核酸上的氧原子進行硫代化、甲基化或用脂質體進行包裹等方法在提高細胞攝入ODN的同時,一方面增加了細胞毒性,同時也降低了核酸反義抑制的效應.將低相對分子質量的聚乙二醇(PEG)連接在 ODN的 5'的末端,結果顯示,細胞內 ODN攝入率明顯增加,高于其他修飾方法,且不影響細胞的生長特性,說明 ODN的 5'末端連接PEG在反義治療領域具有廣闊的應用前景。

3.2 MDR1基因的反義 RNA：ODN的作用是封閉 MDR 1基因而影響基因的轉錄,反義RNA則是與MDR 1基因的 mRNA形成二聚體而抑制 mRNA的翻譯。曹江等利用高表達反義MDR1-RNA重組質粒 pRMAS轉染耐藥細胞 K562/Dox后,其 P-糖蛋白近乎陰性,細胞內柔紅霉素濃度與敏感細胞系K 562幾乎一致,說明 P-糖蛋白介導的藥物外排幾乎完全被抑制,顯示將反義 RNA的模板DNA導入細胞內,可產生大量反義RNA抑制 MDR1基因表達。資料還顯示,細胞除對阿霉素的耐受性完全被逆轉外,對長春新堿(VCR)和柔紅霉素(DNR)的耐受性仍保留 9.0倍和 14.1倍以上,說明 PgP表達轉陰后,MDR并不能完全逆轉,提示還有其他機制作用于細胞的MDR。最近,Nieth等報道應用反義RNA技術抑制胰腺癌細胞株 EPP85-181RDB和腸癌細胞株EPG 85-257RDB中MDR1基因的 91%的表達,兩種細胞對化療藥物柔紅霉素的耐藥性分別降低到 89%和58%,該研究表明特異性阻斷針對PgP依賴的 MDR基因表達可以逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性[11]。

3.3 切割MDR 1mRNA的核酶：核酶(Ribazyme)是正常存在于細胞內并調控基因表達的RNA,是一類具有 RNA限制性內切酶活性的小分子RNA,它特異地與靶 RNA的特定位點結合,識別 RNA序列的 GUN X為 A,C,G)序列并進行切割阻斷目的基因表達,其模型特征具有錘頭結構(Hammerhead)、發(fā)夾狀,其結構相對簡單,可以降解 m RNA,因此也稱為“分子剪刀”。Kobayashi等[12]合成兩個核酶基因,分別切割MDRImRNA 196位和 179位密碼子,將切割 MDRl m RNA 196位密碼子的核酶構建于pHβAPrlneo載體上,電穿孔法導入到耐藥的人急性淋巴母細胞白血病細胞系 MOLT3/TMQ800中,轉染核酶后 MOLT3/TMQ 800對 VCR的耐藥性由原來的 700倍(與其母細胞 MOLT3比較)下降至 20～30倍。在耐藥的胰腺癌細胞系應用核酶逆轉 MDR,耐藥性更是由原來的 1600倍下降至 5.3倍。

目前通過細胞內注射法、電穿孔法、氯化鈣、脂質體介導法進行外源性導入,但在導入細胞過程中極易被核酶降解。用化學方法對核酶加以修飾,可以提高其抵抗核酸酶的能力,但其生物活性明顯減弱。通過逆轉錄病毒的內源性導入,有病毒滴度低、只能逆轉分裂期細胞、細胞內表達率低和潛在致癌性等缺點。Lieber等應用腺病毒載體將核酶基因轉入小鼠體內,證實了核酶基因在完整器官內可以有效表達并發(fā)揮其切割活性。

[1]管曉翔,陳龍邦.腫瘤多藥耐藥性及其研究進展[A]癌癥進展雜志,2004,2(2)：120-121.

[2]Bergman AM,Pinedo HM,Talianidis I,etal.Increased sensitivity to gemcitabine of P-glycoprotein andmulti-drug resistance-associated protein-overexpressing human cancer cell lines.Br[J].Cancer,2003,88(12)：1963.

[3]van der Pol MA,Broxterman HJ,Paler JM,et at.Function of the ABC transporters,P-gtycoprotein,multidrug resistance protein and breast cancer resistance protein,inm inimal residual disease in acute myeloid leukem ia[J].Haematologica,2003,88(2)：134-147.

[4]Gruber A,Bjorkholm M,Brinch L,etat.A phase I/11 study of the MDR modulator Valspodar(PSC833)combined with daunorubicin and cytarabine in patients withrelapsed and primary refractory acutemyeloid leukemia[J].Leuk Res,2003,27：323-328.

[5]Cruz F,Wolf A.Effects of the novel cyclosporine derivative PSC833 on glucosemetabolism in rat primary cultures of neuronaland filial cells[J].Biochem Phannacol,2001,62(1)：129.

[6]阮繼武,多芳基取代咪唑的合成及其逆轉多藥耐藥性研究[J]高等學?；瘜W學報 2007 25(5)870-873.

[7]Jin J,Wang FP,Wei H,Liu G.Reversal ofmultidrug resistance of cancer through inhibition of P-glycoprotein by 5-bromotetrandrine[J].Cancer Chemother Pharmacol,2008,55(2)：179.

[8]Ghetie MA,Marches R,Kufert S,Vitetta ES.An anti-CD 19antibody inhibits the interaction between P-glycoprotein(P-gp)and CD 19,causes P-gp to translocate out of lipid rafts,and chemosensitizes a multidrug-resistant(MDR)lymphoma cell line[J].Blood,2004,104(1)：178.

[9]Yuko H,A rira F,Yves P,etal Differential cytotoxicity ofc linically importantcamptothecin derivatives in P-glycoprotein over expressing cell lines[J].Cancer Chemother Phamnacol,1997,40(5)：433.

[10]Nokihara H,Nishioka Y,Yano S,etal.Monocyte chemoattractant protein-1 genemodification of multi-drug resistant human lung cancer enhances anti metastatic effect of therapy with anti-P-glycoprotein antibody in SCID m ice[J].Cancer,1999,80(5)：773.

[10]Nieth C,Priebsch A,Stege A,etal.Modulation of the classical multi drug resistance(MDR)phenotype by RNA interference(RNAi)[J].FEBS Lett,2003,545(2-3)：144.

[12]Kobayashi H,Takemura Y,Miyachi H.Novel approaches to reversing anti-cancer drug resistance using gene-specific therapeutics[J].Hum Cell.2001,14：172-184.