董安珍

聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）簡稱PCR，是20世紀(jì)80年代中期Cetus公司RaryB.Mullis等人發(fā)明的一種體外酶促基因擴增技術(shù)。它是在體外模擬自然DNA復(fù)制過程，利用人工合成的兩個寡核苷酸引物，分別在靶DNA序列的兩端與兩條模板鏈分端互補的物性經(jīng)過DNA變性，模板一引物復(fù)性和在taqDNA聚合酶催化下引物鏈的延伸反應(yīng)，如此經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸約30個循環(huán)，就可能在短時間內(nèi)將靶DNA擴增數(shù)百萬倍作為分子生物學(xué)方法。PCR法具有快速、簡便、靈敏的特點，是檢測致病菌的發(fā)展方向。

1 常規(guī)PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測中存在的問題

常規(guī)PCR技術(shù)在食源性致病微生物檢測的實際應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性強、靈敏度高、速度快、簡便、高效等特點，為食品檢測技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。但是在實際應(yīng)用中也存在一些不足的地方：（1）食品中的一些糖類、酸類物質(zhì)及油脂等會干擾Taq聚合酶的作用，影響PCR反應(yīng)的正常進行。（2）在食源性致病微生物檢測過程中，可能從環(huán)境及中間處理環(huán)節(jié)帶來一些潛在的PCR反應(yīng)抑制劑和一些其他物質(zhì)，影響PCR反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。（3）引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。（4）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。

2 不同PCR技術(shù)的特點

常規(guī)PCR技術(shù)有其不足之處，不能滿足致病菌檢測的快速準(zhǔn)確的要求。為了提高檢測效率，根據(jù)PCR原理使用了如下技術(shù)應(yīng)用于微生物的快速檢測中。

2.1 RT-PCR技術(shù)（Real-timePCR）

實時定量PCR檢測技術(shù)保留了常規(guī)PCR檢測的特異性和敏感性，整個過程由電腦控制，從加樣到結(jié)果只需要2h左右，可同步完成多個樣品的擴增及定量，適宜于大批樣品的檢測處理，極大地提高了檢測效率，為食品污染的監(jiān)測和食物中毒事件的快速反應(yīng)提供了技術(shù)支持。盡管實時定量PCR檢測比較昂貴，但由于其能對樣品中細菌的污染程度進行定性及定量分析，且靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，更易于自動化，必然會成為細菌檢測的常規(guī)手段。

2.2 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)。它克服了傳統(tǒng)PCR易污染、假陽性率高的缺點，具有操作簡單，結(jié)果直觀、可靠，重復(fù)性、特異性好，靈敏度高，可定量等優(yōu)點?？赏ㄟ^電腦軟件實現(xiàn)實時在線檢測PCR擴增過程得到最終檢測結(jié)果，而無需對擴增產(chǎn)物再次檢測，從而避免了污染。熒光定量PCR還可以實現(xiàn)一管多檢，同時檢測幾個項目。熒光定量PCR技術(shù)的這些特點使得它在食品中進行病原檢測和疫病監(jiān)測時具有其他檢測方法無可比擬的優(yōu)越性，因而成為越來越重要的一種檢測手段。

2.3 PCR-ELISA技術(shù)

PCR-ELISA是在微孔板上對PCR產(chǎn)物進行的快速、非放射性檢測。應(yīng)用PCR法容易出現(xiàn)假陽性，PCR-ELISA引入了探針，具有引物和探針雙重的特異性，并且具備了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點。PCR-ELISA技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上結(jié)合了ELISA這種同樣具有高度敏感性的檢測手段，使生物信號在反應(yīng)過程中逐級放大。因為PCR-ELISA技術(shù)是一個半定量的檢測技術(shù)，具有引物和探針的雙重特異性，并且酶標(biāo)儀讀數(shù)的客觀性，使實驗結(jié)果特異性增強，靈敏度提高，避免了PCR檢測易出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，同時檢測設(shè)備只需普通PCR儀和酶聯(lián)免疫儀，設(shè)備價格低，可以在一般實驗室推廣使用。

2.4 免疫磁珠PCR技術(shù)

免疫磁珠是免疫學(xué)和磁載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來的一類新型材料。IMB是包被有單克隆抗體的磁性微球，可與含有相應(yīng)抗原的靶物質(zhì)特異性地結(jié)合形成新的復(fù)合物。在經(jīng)過短時間的前增菌后，用免疫磁珠法捕獲目的菌，在磁場的作用下與其他物質(zhì)分離，用捕獲的目的菌制備模板DNA，經(jīng)過PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯像進行檢測，該法有效縮短了檢測時間，提高了傳統(tǒng)PCR法的檢出率，檢測設(shè)備只需用普通PCR儀，可以在一般實驗室推廣使用。

2.5 套式PCR技術(shù)

套式PCR，又稱巢式PCR，是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部），結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片斷短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異，檢測設(shè)備只需普通PCR儀，可以在一般實驗室推廣使用。

食品中的致病菌檢測方法很多，主要有傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、PCR、免疫學(xué)方法等。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)程序繁瑣，至少需要幾天才能得出結(jié)論，難以適應(yīng)快速簡便的要求。常規(guī)的PCR方法雖然符合快速簡便等要求，但是它易污染，假陽性高。相比之下，RT-PCR和熒光定量PCR克服了PCR的缺點，但實驗儀器試劑價格昂貴，不利于一般實驗室采用。PCR-ELISA技術(shù)、免疫磁珠PCR技術(shù)、套式PCR技術(shù)結(jié)果可靠、特異性強、靈敏度高、實驗儀器試劑價格相對較低，可在一般實驗室采用，但操作相對復(fù)雜，不可定量檢測。操作者可根據(jù)實驗室條件選擇合適的快速檢測技術(shù)。

如何利用新技術(shù)、新手段盡量消除或減少由于人為因素引起的誤差，提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，同時達到良好的檢測效果，仍然是致病菌質(zhì)量控制工作中值得探討的問題和嘗試的新方向。PCR檢測技術(shù)目前已經(jīng)在國際上獲得廣泛的認(rèn)可，在很大程度上可消除或減少生化鑒定和血清學(xué)試驗，許多步驟依靠操作者的主觀判斷等主觀因素造成誤差，并且具有節(jié)約時間、簡化工作量的優(yōu)點，有益于在今后致病菌檢測中使用。

[1]劉華偉，郭藹光，馬立農(nóng)等．PCR技術(shù)在沙門氏菌快速檢測中的應(yīng)用[J]．動物醫(yī)學(xué)進展，2004，25（6）：55-58．

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