李 俊 ,高成莊 ,王國慶 ,常方方 ,李全民

(1.焦作師范高等?？茖W(xué)校生化系,河南焦作 454000;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系,河南鄭州 450002;3.河南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453007)

0 前言

羅紅霉素為半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,主要作用于革蘭氏陽性菌,厭氧菌,衣原體等。具有用量小,吸收快,作用時間長,穩(wěn)定性好等特點。藥典上記錄的檢測方法為抗生素微生物檢定法[1],比較繁瑣。已報道的分析方法主要有 HPLC[2-5]法、RHPLC[6-8]法、LC[9]法、SP[10]法、荷移反應(yīng)[11-13]。本文首次利用百里酚藍(lán)與羅紅霉素在無水乙醇介質(zhì)中的電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng),研究了最佳反應(yīng)條件,該方法簡便,快捷,條件易于控制,靈敏度高,線性范圍寬,在可見光區(qū)即可完成測定。用于測定藥物制劑中有效成分的含量,所得結(jié)果與文獻(xiàn)[2]方法一致,同時測定了配合物的組成和穩(wěn)定常數(shù),并初步探討了反應(yīng)機(jī)理。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

UV-2800AH型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);722S分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司);CS501型超級恒溫器(重慶試驗設(shè)備廠制造)。1.0×10-2mol/L百里酚藍(lán)(上海試劑三廠)乙醇溶液備用,稀釋至5.0×10-4mol/L;2.5×10-3mol/L羅紅霉素的乙醇溶液(對照品由中國藥品生物制品檢定所提供);所用有機(jī)試劑均為分析純(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

取適量羅紅霉素乙醇溶液于5m L比色管中,濃度為3.1×10-4mol/L,加百里酚藍(lán)溶液1.5 m L,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻后室溫放置10min,以試劑空白為參比,用1 cm比色皿在 438 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的選擇

(1)吸收光譜。按實驗方法配制溶液后,于 UV-2800AH紫外可見分光光度計上進(jìn)行光譜掃描,由實驗可知:羅紅霉素在320580 nm處無吸收,百里酚藍(lán)的最大吸收波長為 547 nm,荷移配合物的最大吸收波長為 438 nm,吸收光譜發(fā)生藍(lán)移,波長變化 109 nm。吸收光譜圖見圖1,故選定檢測波長為438 nm。

(2)反應(yīng)溫度的影響。按實驗方法配制溶液,在不同溫度的水浴中保溫 10min,,取出冷至室溫后測定吸光度,結(jié)果見表1。表1表明吸光度隨反應(yīng)溫度的升高反而降低,說明該反應(yīng)選擇室溫測定較為合適,因此選擇室溫測定。

(3)反應(yīng)時間的影響。按實驗方法配制溶液,放置不同的時間后進(jìn)行測定,結(jié)果表明反應(yīng)10 min后溶液吸光度A基本保持不變,且 10 h內(nèi)穩(wěn)定,本反應(yīng)穩(wěn)定性較好。

(4)溶劑的影響。百里酚藍(lán)難溶于水,研究以甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇為有機(jī)溶劑時配合物的吸光度,分別為0.375,0.108,0.318,0.328。結(jié)果表明:乙醇效果最好。

圖1 吸收光譜

表1 溫度對荷移配合物形成的影響

(5)試劑用量的影響。其他條件不變,改變百里酚藍(lán)的用量,按實驗方法配置一系列溶液,室溫放置10 min后測定吸光度值A(chǔ),百里酚藍(lán)的用量是0.5 mL,1.0m L,1.5mL,2.0mL,2.5m L時,吸光度值A(chǔ)分別為0.196,0.398,0.451,0.432, 0.420。結(jié)果表明百里酚藍(lán)用量1.5 mL為宜。

(6)其他試劑的影響?？疾炝怂氨砻婊钚詣┑挠绊?結(jié)果表明:CTAB、SDS、吐溫-80、吐溫-20的加入均使吸光度有不同程度的降低,見表2。

表2 水和表面活性劑對荷移配合物形成的影響

2.2 線性范圍

按實驗確立的最佳工作條件繪制工作曲線(見圖2),將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理得回歸方程為:A=0.296 9+0.000 62 C,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,羅紅霉素在41.9419mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,表觀摩爾吸光系數(shù)ε為1.70×103L/(molcm)。

2.3 測定方法的重現(xiàn)性實驗

按實驗方法配制溶液8份,室溫放置10 min后測定吸光度A分別為0.428,0.423,0.425,0.426,0.425, 0.427,0.422,0.424;s=0.002,RSD=0.47%。

2.4 配合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定

用連續(xù)變化法(見圖3)和斜率比法(見圖4)測定配合物的組成比為 1∶1,穩(wěn)定常數(shù)為 1.53×106。

圖2 工作曲線

2.5 反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)與反應(yīng)機(jī)理探討

(1)反應(yīng)級數(shù)和反應(yīng)速率方程的確定。按實驗方法配制溶液,分別在 30℃和 40℃下反應(yīng),按初始速率法測定不同時間下吸光度,并由此計算不同溫度下未絡(luò)合的羅紅霉素濃度。分別以A-t、1/A-t、In1/A-t作圖,且都為一直線,由此可知:此荷移反應(yīng)對羅紅霉素為一級反應(yīng);由于在此反應(yīng)中百里酚藍(lán)遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量,可視為常數(shù),故此荷移反應(yīng)可看作為假一級反應(yīng)。速率方程為:

(2)表觀速率常數(shù)和活化能的計算。將上述實驗得到的 A-t數(shù)據(jù)用最小二乘法處理得 30℃和40℃的表觀速率常數(shù)。又據(jù)阿累尼烏斯公式:ln k′=–Ea/RT+C,將各對k′-T數(shù)據(jù)代入公式:Ea=RT1T2/T2-T1lnk2′/k1′中計算出荷移反應(yīng)的活化能,見表3。

(3)反應(yīng)機(jī)理探討。百里酚藍(lán)是一個很強(qiáng)的平面型的 π電子受體,而羅紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,富含電子,可以提供電子而與百里酚藍(lán)形成 1∶1的配合物。

表3 表觀速率常數(shù)和活化能

2.6 回收率實驗

精密稱取處方量輔料9份,分別按羅紅霉素(150mg/L)標(biāo)示量的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)品各3份,測定回收率,結(jié)果分別為100.2%、101.4%、100.8%,RSD分別為0.43%、0.49%、0.47%。

2.7 試樣的測定

(1)試樣的準(zhǔn)備。取羅紅霉素膠囊10粒(150mg/粒),精確稱量,混勻,準(zhǔn)確稱取適量藥粉,用乙醇溶解,轉(zhuǎn)移到 100m L容量瓶中,用乙醇定容,搖勻,取續(xù)濾液使用。

表4 試樣的測定結(jié)果

(2)試樣的測定。取適量試樣溶液于 5 mL比色管中,加入1.5m L百里酚藍(lán),按實驗方法平行制3份溶液。測定吸光度A,按回歸方程計算含量,與文獻(xiàn)[2]對比,測定制劑中羅紅霉素的含量。本法測定結(jié)果與文獻(xiàn)[2]方法基本一致(150mg/粒),結(jié)果見表4。

[1] 中華人民共和國藥典委員會,中華人民共和國國家藥典:二部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:388.

[2] 戴 紅,胡昌勤.HPLC法分析羅紅霉素及其片劑含量和相關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志,2002,22,(3):185-188.

[3] 王 芳,賴日禹.高效液相色譜法測定羅紅霉素顆粒含量[J].藥物分析雜志,2001,21(6):442-443.

[4] 田 潔,胡昌勤,張正行.羅紅霉素及其有關(guān)物質(zhì)快速HPLC分析方法的探討[J].藥物分析雜志,2003,23(6):434-437.

[5] 丁晨光,范 青,鐘紅玲,等.羅紅霉素的HPLC測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1998,29(3):122-124.

[6] 趙亞男,李相鴻,楊菁菁,等.RP-HPLC法測定人體血漿中羅紅霉素的濃度[J].藥物分析雜志,2006,26(5):618.

[7] 李偉華,閆惠平,黃 春,等.反相高效液相色譜法測定羅紅霉素血藥濃度[J].藥物分析雜志,2006,26(8):1103-1105.

[8] 秦永平,黃 英,梁茂植,等.血清中羅紅霉素的反相高效液相色譜法測定[J].藥物分析雜志,1997,17(4):249.

[9] Maria Hedenmo,Britt-Marie Eriksson.Liquid Chromatographic Determ ination of the Macrolide Antibiotics Roxithromycin and Clarithromycin in Plasma Byautomated Solid-phase Extraction and Electrochemical Detection[J].JChromatogr A, 1995,692(1/2):161-166.

[10] 張敏波,張琪霞,金耀楚.羅紅霉素片溶出度的分光光度測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1996,27(6):260-261.

[11] 趙桂芝,李華侃.荷移分光光度法測定羅紅霉素[J].光譜學(xué)與光譜分析,2003,23(1):157-159.

[12] 白秀珍,李華侃,劉中英,等.荷移分光光度法測定羅紅霉素[J].藥物分析雜志,2005,25(4):429-431.

[13] 李 俊,李全民,王新明.羅紅霉素的荷移分光光度法測定[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2006,18(9):1081-1083.