程世平,施 江,史國(guó)安,李亞杰,宋程威,尹小芳

(河南科技大學(xué)洛陽(yáng)市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南洛陽(yáng) 471003)

0 前言

黃連木(Pistacia chinensis Bunge)屬漆樹(shù)科黃連木屬,落葉喬木,雌雄異株,分布廣泛,可作觀賞樹(shù)種,更是優(yōu)良的油料及用材林樹(shù)種。黃連木種子所含的油可作工業(yè)原料或用作食用油,是生產(chǎn)生物柴油的理想木本油料[1-2],黃連木還可藥用[3]。目前對(duì)黃連木的研究主要集中在組織培養(yǎng)[4]、種子發(fā)芽試驗(yàn)和病蟲(chóng)害防治[5]等方面,有關(guān)黃連木分子生物學(xué)相關(guān)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

高質(zhì)量的DNA是分子生物學(xué)關(guān)鍵的一步,是進(jìn)行分子標(biāo)記、基因組文庫(kù)構(gòu)建、親緣關(guān)系分析等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。植物DNA提取的方法多種多樣,CTAB法經(jīng)改良后被廣泛應(yīng)用,針對(duì)不同植物材料的特點(diǎn),對(duì)CTAB法所做的改良各不相同,本文針對(duì)黃連木這種富含酚類、色素等極易影響DNA提取的物質(zhì),進(jìn)行了相對(duì)應(yīng)的改良,得出了一種簡(jiǎn)單、有效的提取黃連木 DNA的方法,為黃連木分子生物學(xué)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為黃連木嫩葉,葉片采下后立即裝入自封袋,放入裝有冰袋的采樣盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,用蒸餾水沖洗干凈、用濾紙吸干表面水分,置于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

(1)常規(guī)CTAB提取方法按文獻(xiàn)[6]的方法。

(2)改良CTAB法的操作步驟。參照文獻(xiàn)[7-10]的方法并作適當(dāng)改良,進(jìn)行黃連木葉片DNA提取。①將CTAB提取液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.4 mmol/L NaCl,50 mmol/L EDTA),加入3% CTAB后,放入65℃水浴鍋進(jìn)行水浴。②待CTAB完全溶解后,每個(gè)10m L離心管中分裝3 mL CTAB提取緩沖液,繼續(xù)放入 65℃水浴。③取 3 g左右葉片,于液氮冷凍條件下迅速研磨成粉末,立即轉(zhuǎn)入裝有提取緩沖液的離心管中。④每個(gè)離心管中加入 120μLβ-巰基乙醇,20%的PVP溶液 520μL,5μL RNA酶(5mg/mL),迅速混勻。⑤65℃水浴1 h,期間每隔5min振蕩1次。⑥放至室溫后,加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1),抽提 2次。⑦上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中,加入 2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,上下輕輕顛倒。⑧待出現(xiàn)大量沉淀時(shí),挑出絮狀DNA沉淀,將沉淀轉(zhuǎn)入1.5mL離心管。⑨用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌1次?！?0將離心管口打開(kāi),在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)吹58 min。○11加入1m L 1×TE溶液,待DNA完全溶解后分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)DNA純度及濃度檢測(cè)。將 DNA樣品按照一定倍數(shù)稀釋后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280值,按照1個(gè)OD260值相當(dāng)于50 ng/μL和稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算DNA的濃度,用 OD260和OD280的比值表示DNA的濃度,最后將DNA樣品稀釋,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,用核酸染料(GeneFinder)染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照,檢測(cè)DNA的純度及完整性。

(4)RAPD檢測(cè)。以所提DNA為模板,用RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序參考Surya Prakash等[11]的方法并作適當(dāng)改動(dòng),引物購(gòu)自上海Sangon。擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸染料染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)CTAB法提取黃連木葉片基因組DNA

采用常規(guī)CTAB提取方法,上清液在提取DNA的同時(shí),富含大量的蛋白質(zhì)、RNA、單寧、色素等物質(zhì),經(jīng)沉淀出現(xiàn)的絮狀DNA呈深綠色或黑褐色,溶解后的DNA較粘稠。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),DNA點(diǎn)樣量5μL才出現(xiàn)微弱條帶,且電泳孔道出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)和RNA等(如圖1所示)。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)表明,其紫外吸收比值在 1.53左右。

2.2 改良CTAB法提取黃連木葉片基因組DNA

改良后的CTAB法盡量縮短了研磨樣品與空氣接觸的時(shí)間;提取過(guò)程中充分振蕩增加了提取液和研磨樣品快速、充分的接觸,有效去除了蛋白、色素等雜質(zhì)。加入無(wú)水乙醇待 DNA析出時(shí),立刻將沉淀挑出,防止多酚、單寧、多糖等物質(zhì)與 DNA沉淀在一起,另外不采用離心方法沉淀DNA,有效避免了雜質(zhì)和DNA混合在一起。

電泳點(diǎn)樣量?jī)H1μL,從電泳圖(如圖2所示)可知,改良法提取的DNA無(wú)蛋白、RNA等污染,條帶清晰,亮度均一,純度、完整性較高。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),其吸收比值 1.8左右。

2.3 RAPD擴(kuò)增檢測(cè)黃連木葉片基因組DNA的提取效果

運(yùn)用常規(guī)CTAB方法提取的黃連木基因組DNA,經(jīng)RAPD隨機(jī)引物擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),條帶模糊且片狀拖帶或涂抹帶現(xiàn)象明顯,擴(kuò)增主帶不明顯。

采用改良法提取的DNA,進(jìn)行RAPD基因擴(kuò)增,擴(kuò)增所用DNA隨機(jī)選擇,1和2,3和4,5和6,7和8,9和 10,11和12所用引物相同,RAPD擴(kuò)增結(jié)果表明(如圖3所示),同一引物之間擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、豐富。同一條引物之間擴(kuò)增的條帶有少許差異,是因?yàn)榇菩勰０逯g的差異所致。結(jié)果表明:改良法提取的DNA能較好的用于PCR擴(kuò)增研究。

3 討論與結(jié)論

高質(zhì)量的DNA樣品是進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ),根據(jù)不同植物材料的特點(diǎn),提取基因組DNA的方法也不盡相同。CTAB提取法在植物DNA提取過(guò)程中應(yīng)用最廣泛,提取效果較理想。黃連木葉片富含單寧、多酚、色素等物質(zhì),給DNA提取帶來(lái)很大困難。本試驗(yàn)在常規(guī) CTAB提取方法的基礎(chǔ)上,針對(duì)黃連木葉片的特點(diǎn),進(jìn)一步對(duì)提取方法進(jìn)行完善,設(shè)法減少酚類物質(zhì)、色素、多糖等物質(zhì)的干擾。

圖3 改良CTAB法提取黃連木DNA的RAPD擴(kuò)增效果圖

為了盡量減少材料的褐化,并顯著提高提取效果,首先將提取液分裝并水浴保持在65℃,研磨后將研磨樣品立即加入提取液;另外使用β-巰基乙醇和PVP的組合也有效避免了DNA在抽提過(guò)程中的褐變。因?yàn)?PVP是一種高分子合成樹(shù)脂,能絡(luò)合多酚物質(zhì),防止酚類化合物氧化成醌類,避免了溶液褐化具有抗氧化作用[12],β-巰基乙醇的巰基能與酚類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)氧,有效避免了酚類物質(zhì)氧化成醌,避免材料的褐變[13]。

為了簡(jiǎn)化提取過(guò)程,在加入研磨樣的同時(shí)加入RNA酶,并進(jìn)行短暫振蕩可有效除去 RNA;為了防止多酚、單寧、多糖等次生代謝物質(zhì)與 DNA一起沉淀[14],在加入預(yù)冷無(wú)水乙醇,輕輕上下混勻后,待大量絮狀沉淀產(chǎn)生時(shí),立即挑出DNA絮狀沉淀,一定不能離心。否則,雜質(zhì)都和DNA混在一起。

經(jīng)改良的DNA提取方法,提取的DNA質(zhì)量較好,并且簡(jiǎn)化了提取步驟。提取的DNA能直接用于PCR擴(kuò)增等相關(guān)的分子生物學(xué)研究。

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