林智

（遼寧職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，遼寧鐵嶺112000）

食品中蛋白質(zhì)含量的測定*

林智

（遼寧職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，遼寧鐵嶺112000）

我國現(xiàn)行標準GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的兩種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯（Dumas）燃燒法是先將樣品硝化后測出含氮量，然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計算蛋白質(zhì)的含量，如果添加含氮量高的物質(zhì)，如三聚氰胺，就可以測出較高的“蛋白質(zhì)含量”。介紹4種直接測定蛋白質(zhì)的方法：考馬斯亮蘭法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法和紫外吸收光譜法，可以避免上述由于添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)造成測定蛋白質(zhì)含量虛高的結(jié)果。

蛋白質(zhì)含量；考馬斯亮蘭法；雙縮脲法；Folin－酚試劑法；紫外吸收光譜法

2008 年毒奶粉事件再次敲響了食品安全的警鐘，不法分子為了提高摻水牛奶中蛋白質(zhì)的含量，添加工業(yè)原料三聚氰胺，由于我國現(xiàn)行標準GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的2種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯（Dumas）燃燒法只能測出含氮量，然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計算蛋白質(zhì)的含量，但并不能區(qū)分牛奶硝化后氮的來源，如果添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)，就可以測出較高的“蛋白質(zhì)含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，只要含氮量大于牛奶中蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，且性狀和價格具備條件，在理論上都存在被不法分子利用的可能性?！岸ǖ狈椒ǖ南忍觳蛔阋蟛捎闷渌臋z測方法來應(yīng)對，下面介紹幾種直接測定蛋白質(zhì)的方法。

1 直接測定蛋白質(zhì)方法

1.1 考馬斯亮蘭法

1976 年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。在酸性溶液中，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合變?yōu)樘m色，在595 nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。此法靈敏度較高1～5μg，時間15 min左右，干擾物質(zhì)：強堿性緩沖溶液；SDS；TritonX-100。標準曲線有輕微的非線性，各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。

1.1.1 實驗用品

標準蛋白質(zhì)溶液：用g-球蛋白或牛血清蛋白（BSA），配制成1.0 mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。

考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100 mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50 mL 95%的乙醇后，再加入120 mL 85%的磷酸，用水稀釋至1 L。

可見光分光光度計；旋渦混合器；比色管；吸量管。

1.1.2 實驗步驟

（1）標準曲線的制作：取7支比色管，分別加入0.00，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL的1.0 mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液，然后用無離子水補充到0.1 mL。最后各試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完1管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。加完試劑2～5 min后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595 nm處的光吸收值。用標準蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標，用吸光度值為縱坐標，作圖，即得到一條標準曲線。

（2）未知樣品的測定：處理樣品，稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi),取3支比色管分別加0.02，0.04，0.06 mL未知樣，用無離子水補充到0.1 mL，分別加入5.0 mL考馬斯亮蘭G—250試劑，在旋渦混合器上混合，在分光光度計上測定各樣品在595 nm處的光吸收值，根據(jù)測出的未知樣品的吸光度值，由標準曲線，既可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2 雙縮脲法[1-3]

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4結(jié)合形成紅紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，蛋白質(zhì)的種類雖不同，但發(fā)色率差別不大，組氨酸以外其它游離的氨基酸、二肽等不顯色，除雙縮脲、一亞氨基雙縮脲、二亞氨基雙縮脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少數(shù)化合物以外，非蛋白質(zhì)均不顯色，可以看做這是蛋白質(zhì)的特有反應(yīng)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。此法靈敏度較低1～20 mg，時間30 min左右，干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等，常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。

1.2.1 試劑與器材

標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10 mg/mL的標準蛋白溶液，可用BSA質(zhì)量濃度1 mg/mL的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清蛋白用H2O或質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl配制，酪蛋白用0.05 mol NaOH配制。

雙縮脲試劑：稱以1.50 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500 mL水溶解，在攪拌下加入300 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的NaOH溶液，用水稀釋到1 L，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

紫外光分光光度計；比色管；旋渦混合器等。

1.2.2 實驗步驟

（1）標準曲線的測定：取12支比色管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30 min，于540 nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取2組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，吸光度值為縱座標繪制標準曲線。

（2）樣品的測定：處理樣品,稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，取3支比色管分別加0.02，0.04，0.06 mL未知樣，用上述同樣的方法，測定未知樣品的吸光度值。根據(jù)測出的未知樣品的吸光度值，由標準曲線，既可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3 Folin－酚試劑法[2-3]

酚試劑法就是來自酚試劑（磷鉬酸、磷鎢酸的混合液），在堿性條件下，和蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的呈色反應(yīng)與雙縮尿反應(yīng)的復(fù)合方法。磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。此法靈敏度高5μg左右，時間1 h左右，干擾物質(zhì)：尿素、硫酸納、硝酸納、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等，測定時要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

1.3.1 試劑與器材

試劑甲：（A）10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500 mL蒸餾水中。（B）0.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100 mL蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

試劑乙：在2 L磨口回流瓶中，加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O），25 g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及700 mL蒸餾水，再加50 mL85%磷酸，100 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10 h，回流結(jié)束時，加入150 g硫酸鋰（Li2SO4），50 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1 L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1 mol左右。

標準蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，質(zhì)量濃度為250 mg/mL左右。牛血清蛋白溶于水若混濁，可改用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液。

可見光分光光度計；旋渦混合器；秒表；比色管。

1.3.2 實驗步驟

（1）標準曲線的測定：取16支比色管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL標準蛋白質(zhì)溶液（質(zhì)量濃度為250 mg/mL）。用水補足到1.0 mL，然后每支試管加入5 mL試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10 min。再逐管加入0.5 mL試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700 nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。

因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5 mL試劑甲后，開始計時，1 min后，第2支試管加入5 mL試劑甲，2 min后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10 min，則第1支試管可立即加入0.5 mL試劑乙，1 min后第2支試管加入0.5 mL試劑乙，2 min后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30 min，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。

（2）樣品的測定：取1 mL樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20～250 μg），按上述方法進行操作，取1 mL蒸餾水代替樣品作為空白對照。測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

1.4 紫外吸收光譜法[2-3]

紫外吸收光譜法是直接測定芳香族氨基酸對紫外線吸收光譜（酪氨酸和色氨酸的最大吸收為280nm）及肽鍵對紫外線吸收光譜（肽鍵的最大吸收為190 nm）來定量蛋白質(zhì)的一種分析方法。

1.4.1 試劑與器材

97%（質(zhì)量分數(shù)）醋酸溶液；紫外分光光度計。

1.4.2 實驗步驟

（1）標準曲線的測定：用移液管吸取牛乳0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL分別置于5只洗凈烘干的比色管中，以質(zhì)量分數(shù)為97%的醋酸溶液定容至25 mL。搖動1 min，于紫外分光光度計用1 cm的比色皿于280 nm測定其吸光度。繪制標準曲線。

（2）樣品的測定：用移液管準確吸取牛乳樣品0.3 mL，操作同上。由標準曲線可計算出樣品中蛋白質(zhì)的百分數(shù)。

2 結(jié)束語

綜上，這幾種直接測定食品中蛋白質(zhì)的方法，靈敏度高低不同，可以滿足不同類型蛋白質(zhì)的檢測，可防止不法分子用添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)來獲得較高的蛋白質(zhì)。當(dāng)然，為了確保食品安全，食品檢測還是應(yīng)該根據(jù)實際情況采取不同的檢測方法或同時用幾種方法互相驗證，這樣才能不給不法分子可乘機會，確保食品安全。

[1]吳梧桐.生物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[2]陳毓荃.生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[3]陳雅蕙.生物化學(xué)實驗原理和方法[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社，2008.

[4]陳來同.生化工藝學(xué)實驗教程[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[5]武漢大學(xué).分析化學(xué)[M].5版.北京：高等教育出版社，2006.

The Determination of the Protein Content in Food

LIN Zhi

（Liaoning Vocational College Department of Basic Courses，Liaoning Tieling 112000，China）

According to the current standard of Determination of Protein Content in Food GB/T5009.5-2003 in China，there are two methods to determine the protein content.They are Kjeldahl method of nitrogen determination and Dumas method.Both of the two ways determine the nitrogen content by nitrification firstly and then calculate the protein content according to the conversion coefficient between the nitrogen and protein.If such high nitrogen content chemical substance as Melamine is added to the food，the protein content will be higher accordingly.In this peper，four direct determination methods were introduced including Bradford method，Biuret method，Lowry method and ultraviolet absorption spectrometry.These methods are more precise to determine the protein content in food than Kjedahl method which often overstates the protein content due to adding the high nitrogen-containing substances.

Protein Content；Bradford method；Biuret method；Lowry method；Ultraviolet Absorption Spectrometry

TQ937

A

1671-0460（2010）02-0224-03

2009-12-01

林智（1970-），男，講師，畢業(yè)于青島海洋大學(xué)化學(xué)系化學(xué)專業(yè)。E-mail：lzsllljp@163.com。