趙志荀,吳國華,顏新敏,張 強(qiáng)*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室,甘肅蘭州 730046;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

羊痘病毒(Capripox virus,CPV)是最重要的動物痘病毒,在分類地位上屬于痘病毒科(Poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxrinae)中的羊痘病毒屬(Capripoxvirus)成員,包括山羊痘病毒(Goat pox virus,GPV)、綿羊痘病毒(Sheep pox virus,SPV)和牛結(jié)節(jié)疹病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)[1]。作為山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹病的致病因子,CPV能引起這些動物最為嚴(yán)重的疾病[2]。在非洲、中東、中亞以及印度,SPV、GPV對小反芻獸產(chǎn)生了極大影響,在這個些地方它們的流行常常導(dǎo)致易感動物很高的發(fā)病率和死亡率[3-4]。而相反,LSDV限于非洲大陸和馬達(dá)加斯加存在,而且牛的結(jié)節(jié)性疹塊病發(fā)病率不定,死亡率低[5]。

最近幾十年,科研人員對CPV進(jìn)行了大量研究,許多實驗室都做了大量工作,試圖通過一步步深入的研究,能夠控制、消滅羊痘。隨著CPV基因組的公布,幾年的時間內(nèi),大量文獻(xiàn)報道了CPV研究情況。文章就CPV的分子生物學(xué)以及其相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展做一綜述。

1 病毒基本特征

CPV為卵圓形或磚形病毒,胞漿內(nèi)復(fù)制,其基因組是雙鏈DNA,其大小約為290 nm×270 nm。CPV由1個核、2個側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成,屬于較小的痘病毒病毒粒子。CPV的衣殼有囊膜,囊膜內(nèi)含有病毒特異性蛋白。核是由DNA和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復(fù)合體,位于病毒粒子的中央,呈兩面凹陷,凹陷內(nèi)分布有2個側(cè)體。核和側(cè)體一起由脂蛋白性表面膜包圍,其間充填有可溶性蛋白,一層?xùn)艡跔畹暮诵哪ぞo貼于核心周圍。

CPV對干燥有較強(qiáng)的抵抗力,在干燥的痂皮內(nèi)可存活3個月～6個月,在干燥羊舍內(nèi)可存活6個月～8個月[6]。反復(fù)凍融對其沒有明顯的滅活作用,但對直射陽光、常用消毒藥以及乙醚或氯仿敏感,放線菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒復(fù)制。CPV可在牛、綿羊、山羊源的組織培養(yǎng)細(xì)胞上生長,原代、次代羔羊睪丸細(xì)胞和腎細(xì)胞最為敏感[7],也可用Vero細(xì)胞等細(xì)胞系對CPV進(jìn)行培養(yǎng)。CPV接種細(xì)胞后最早可在感染后4 d使少量細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變,之后的4 d～6 d細(xì)胞病變迅速擴(kuò)展到整個細(xì)胞層。觀察是否有CPE出現(xiàn)最多可達(dá)14 d。

2 CPV的基因組結(jié)構(gòu)

CPV基因組較大,由143 kb～147 kb堿基組成,A+T含量約為75%。CPV含有147個開放閱讀框(opening read frame,ORF),編碼密度約為93%,能夠編碼53個～2 027個氨基酸。CPV的基因組由中間編碼區(qū)和兩端相同的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat,ITR)構(gòu)成。

中間編碼區(qū)[(ORFs024～123)]是一個與痘苗病毒(Vaccinea virus,VV)基因的所有保守基因同源的核心編碼區(qū)域,其左側(cè)和右側(cè)的10～27 kb的基因結(jié)構(gòu)中包含有重要的編碼功能的基因序列,含有基因編碼病毒復(fù)制的必需因子其參與病毒轉(zhuǎn)錄、RNA修正、病毒DNA復(fù)制、病毒粒子的構(gòu)建和裝配等。

兩端IT R(ORFs001～023,ORFs124～156)長度均約為2.3 kb,保守性較低,但含有一些功能基因家族,與病毒感染的宿主范圍、毒力等特性有關(guān)。這些基因家族包含5個ankyrin基因重復(fù)序列和3個kelch基因重復(fù)序列,還有一些細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、IL-10、表皮生長因子樣蛋白、PKP抑制因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、痘病毒特異性毒力基因等的同源序列,它們編碼的蛋白質(zhì)與病毒的修飾、病毒在宿主細(xì)胞中的逃逸、細(xì)胞凋亡以及免疫應(yīng)答等有關(guān)[8-9]。IT R最末端是兩條鏈交叉連接的發(fā)卡環(huán),緊接著是由兩套獨特序列隔開的串聯(lián)重復(fù)序列。SPPV的ITR上的串聯(lián)重復(fù)序列大小為46 bp,LSDV的為5 bp,而在GTPV的IT R上則不存在串聯(lián)重復(fù)序列。

3 CPV毒力相關(guān)基因及蛋白研究概況

3.1 P32基因及其編碼蛋白

3.1.1 p32基因 p32基因位于CPV基因組的64～65 kbp處,由第74號 ORF編碼,是CPV 基因組的長3.7 kbp HindⅢ、PstⅠ片段的一部分。HindⅢ、PstⅠ片段含有5個ORF,分別與VV的J6R、H1L、H2L、H3L、H4L 基因同源,即P32基因與編碼位于胞內(nèi)成熟VV病毒粒子表面的p35蛋白的基因具有同源性。

SPPV、GTPV的 p32基因的閱讀框分別由323、322個氨基酸組成,分別由972 bp、969 bp的堿基編碼。它們在基因組成上高度保守,在核苷酸水平和氨基酸水平上分別有97.5%和94.7%的同源性[10]。兩者P32基因最主要的區(qū)別是在SPPV的P32序列中的55位處是天冬氨酸,而在GTPV和LSDV中不存在。GTPV和SPPV的p32基因有兩個EcoRV酶切位點,而在LSDV中則沒有EcoRV酶切位點的存在。

3.1.2 結(jié)構(gòu)蛋白p32 p32蛋白是從CPV感染細(xì)胞中分離得到的結(jié)構(gòu)蛋白,分子質(zhì)量為32 ku。此蛋白為CPV的各毒株所共有且含有重要的抗原決定簇,它能夠刺激豚鼠迅速產(chǎn)生抗CPV的中和抗體。p32蛋白是CPV的囊膜蛋白,由319個～324個氨基酸組成,具有跨膜的螺旋結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)位于C端287位～307位氨基酸處。現(xiàn)已證實p32蛋白是羊痘病毒屬特有的蛋白,存在于所有已分離的CPV毒株中,其單一血清可以中和CPV感染早期產(chǎn)生的抗體。因此P32基因可作為羊痘PCR診斷的目的基因。

3.1.3 P32基因克隆、表達(dá)及應(yīng)用 p32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的CPV共有且特異很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白。獲得可溶性的p32蛋白是進(jìn)行CPV抗體檢測以及進(jìn)行亞單位疫苗研制的前提條件。因此到目前為止,基于p32結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的克隆、表達(dá)已相當(dāng)多。國內(nèi)外研究人員已構(gòu)建了各種各樣的連接載體和表達(dá)載體,也取得了不同程度的成果。

早在1994年,Chand P等[11]利用大腸埃希菌表達(dá)了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合和多聚組氨酸融合的重組p32蛋白,并以該重組蛋白作為抗原建立間接ELISA方法,而且證明了重組蛋白與正痘病毒和副痘病毒陽性血清均沒有反應(yīng)。

全長p32蛋白可溶性最大,且在ELISA中的反應(yīng)性最好。近年來,國內(nèi)不少研究人員擴(kuò)增了P32基因,克隆至不同載體,并分別在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)了有一定活性的目的蛋白。但由于p32蛋白的跨膜區(qū)對細(xì)胞具有毒性作用,使其表達(dá)量低,很難純化到重組p32蛋白[12]。于是,國內(nèi)外研究者便以截去跨膜區(qū)的P32基因為研究對象,研究其重組蛋白的用途。Chand P等[11]曾用截去跨膜區(qū)的重組p32蛋白為抗原,研究了檢測抗體的間接ELISA方法,該法快速、可靠,且沒有傳染性。但是最近的研究結(jié)果表明,全長p32蛋白截去跨膜區(qū)后,對其免疫原性有一定的影響[13]。

3.2 非結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)基因

3.2.1 TK基因的研究 多種DNA病毒具有胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)編碼的胸腺嘧啶核苷激酶。CPV的TK基因位于基因組中部ORF66處,距離兩端的ITR分別為52 kb和91 kb。TK基因編碼174個氨基酸的多肽,這些多肽與 VV的J2R基因編碼多肽的同源性約66%。在痘病毒科中不同屬的痘病毒 TK基因的位置不同[14],在CPV、VV、雞痘病毒(Fowl pox virus,FPV)中 TK基因分別位于基因組的3個不同的位置。Amano H等[15]猜測,這種位置的不固定性很可能是在痘病毒進(jìn)化過程中,由于痘病毒的基因組重排造成的。盡管存在位置不固定,但TK基因均位于基因組的中間區(qū)域而且具有較高的保守性。

CPV擁有龐大的基因組和許多非必需區(qū),具有研究基因缺失疫苗和病毒活載體的巨大潛力。TK基因是CPV的主要毒力基因,也是病毒復(fù)制的非必需基因,缺失T K基因的CPV突變株在細(xì)胞中的復(fù)制能力極大減弱,因而使疫苗更安全。

目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于TK基因重組病毒的構(gòu)建。Bhanuprakash V等[16]利用TK基因作為非必需區(qū)構(gòu)建了重組CPV。郭巍等[17]克隆了我國山羊痘弱毒疫苗(GT PV-TY)的 TK基因,并利用同源重組構(gòu)建了帶有同源重組臂和篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移載體。鄭敏[18]通過試驗研究獲得一株性狀穩(wěn)定并保持形態(tài)、生長性能和免疫原性不變,但對山羊致病力降低的TK基因缺陷毒株;其整個試驗結(jié)果還證實了GTPV的serpin蛋白可通過抑制caspase-8活性而抑制細(xì)胞凋亡。不過,目前GTPV缺失疫苗和活載體的研究依然處于起步階段。但是上述研究無疑也將會對活載體缺失疫苗的研制進(jìn)一步奠定基礎(chǔ)。

3.2.2 ITR基因及其在CPV分子診斷中的應(yīng)用

目前,國內(nèi)應(yīng)用PCR方法檢測CPV主要是針對p32蛋白基因,但是針對p32蛋白基因檢測往往也存在不足,而對于同一樣本針對ITR基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,能夠較容易的檢測出病毒的存在。因此,有人便基于ITR基因片段進(jìn)行研究,試圖另外找到可應(yīng)用PCR方法檢測的更為保守、敏感的CPV的基因片段。

Mangana V O等[19]用CPV的KS-1株和InS-1株的IT R為為目的基因設(shè)計引物建立了鑒別SSPV的簡單、快速、特異的PCR方法,能將SPPV與GTPV和皰疹病毒(Herpesviruses)區(qū)分開;Markoulatos P等[20]用IT R和α微管蛋白為目的基因設(shè)計引物,建立了檢測皮膚組織中的SPPV和羊傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus,CEV)的多重PCR技術(shù),該技術(shù)采用3對引物、一步擴(kuò)增方法,比用單一引物的PCR方法更快、更敏感。

徐春志等[21]和王開功等[22]分別應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向ITR 片段,并將其克隆至 pMD18-T載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-ITR,再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),對通過PCR、酶切鑒定為陽性的重組菌進(jìn)行序列測定。徐春志等將所得序列與Gen-Bank收錄的2株山羊病毒、3株綿羊痘病毒全基因序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果所測 4個毒株序列與GenBank上收錄的GTPV的該片段核苷酸序列的同源性均100%,與SSPV的該片段核苷酸序列的同源性均為98.3%。王開功等研究也表明,4株病毒都可得到一條長度均為289 bp的DNA片段,該片段可被內(nèi)切酶 AluⅠ特異識別,而且該P(yáng)CR的DNA模板最小檢出量為24.40pg。

與此同時,羅阿東等[23]根據(jù)CPV的 ITR的核苷酸序列設(shè)計引物,以CPV的DNA為模板,建立并優(yōu)化了SYBR Green I模式熒光PCR檢測GPV的ITR基因的方法,并與普通PCR方法進(jìn)行敏感性比較。結(jié)果表明,建立的檢測 GPV的 SYBR Green I熒光PCR方法能檢測出7×102拷貝數(shù)的DNA模板比文獻(xiàn)報道的普通PCR法更敏感、準(zhǔn)確、快速。

他們的研究結(jié)果均表明,ITR基因片段在羊痘病毒屬中也很保守,可以針對IT R基因建立CPV的PCR檢測方法。

4 CPV分子檢測

目前國內(nèi)基于CPV不同的基因建立了不同的分子檢測方法,但是每個方法都不是完美的。如建立在P32基因的PCR方法,以及最近Balamurugan V等[24]構(gòu)建的熒光定量PCR方法均各自有不同的不足。而盡管基于重組P32建立的ELISA方法具有高度的特異性且與正痘病毒和副痘病毒沒有交叉反應(yīng),但由于全長P32表達(dá)量低,很難得以推廣使用。因此國內(nèi)外不少研究人員[25-26]正研究CPV的其他特異性強(qiáng)、表達(dá)量高的功能基因,試圖建立出CPV的診斷檢測的新途徑。

5 疫苗研制

5.1 CPV傳統(tǒng)疫苗

國內(nèi)外科研人員通過廣泛使用許多CPV毒株作為活疫苗,成功制備了二十多種滅活或弱毒疫苗。有的免疫后保護(hù)力可長達(dá)1年以上,有的甚至終生免疫。我國使用的疫苗主要是1958年沈榮顯等將分離得到的GTPV太原株經(jīng)過雞胚化致弱而制成的弱毒疫苗,其免疫期可達(dá)1年。而滅活苗往往只能提供暫時性的保護(hù),因為以組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的滅活疫苗的病毒粒子不具備完整囊膜,接種動物后不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生對帶有完整囊膜的病毒粒子的免疫力。而且滅活疫苗通常不能有效激活細(xì)胞免疫,而CPV的免疫反應(yīng)則主要是細(xì)胞免疫。所以滅活苗的效果常常不是很好。而且活疫苗在非疫區(qū)使用時存在有病毒擴(kuò)散的可能,所以尚需科研人員對CPV疫苗做進(jìn)一步研究,期望在深入了解CPV的毒性和宿主范圍的基因基礎(chǔ)上,能夠增加疫苗設(shè)計的有效性和多功能性。

5.2 CPV亞單位疫苗

p32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的所有CPV共有且特異很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白,但是要獲得基于p32的CPV亞單位疫苗,必須先得到可溶性的p32蛋白。Carn V M等[27]曾研究了大腸埃希菌表達(dá)的GST融合重組p32蛋白混合弗氏佐劑對試驗山羊進(jìn)行肌肉注射接種,并對重組蛋白的保護(hù)性進(jìn)行了研究。試驗結(jié)果證明將GST p32配以佐劑接種山羊可以提高病毒中和抗體水平,降低CPV強(qiáng)毒感染引起的臨床癥狀。雖然不能阻止病毒在攻毒部位的復(fù)制,但是可以阻止病毒向周圍的擴(kuò)散,并且使動物對病毒的反應(yīng)更加敏感。

但是在由于p32蛋白在表達(dá)的過程中會出現(xiàn)表達(dá)量低、表達(dá)不穩(wěn)定等問題,這就在一定程度上制約著p32蛋白開發(fā)成亞單位疫苗的應(yīng)用前景。因此在CPV中尋找到免疫原性更好、表達(dá)量更大、表達(dá)更穩(wěn)定的基因是十分重要的。

5.3 CPV基因缺失疫苗

CPV的宿主范圍專一,僅感染山羊、綿羊和牛這類反芻動物,因此更具有用作載體研制活載體疫苗的優(yōu)勢。使用基因工程技術(shù)去除CPV的毒力相關(guān)的特定基因或基因片段可進(jìn)一步獲得的缺失疫苗。目前大多數(shù)研究者都試圖通過缺失TK基因來實現(xiàn)。如王芳等[28]構(gòu)建TK基因缺失重組病毒以為獲得能區(qū)分自然感染和疫苗免疫的基因工程標(biāo)記疫苗,郭巍等將LacZ基因表達(dá)盒插入TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體篩選了TK基因缺失的GTP-VTY突變株。但是截至目前仍沒有正式使用CPV缺失疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防CPV的報道。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,人們對CPV的認(rèn)識逐漸深入。在基因組結(jié)構(gòu)與功能、基因定位和基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究不斷取得進(jìn)展,這也將對研發(fā)更為有效安全的基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

6 結(jié)論

隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展,目前對CPV的研究已經(jīng)逐漸更為全面而深入。在以p32蛋白為研究熱點以外,展開對CPV其他特異性強(qiáng)、表達(dá)量高的基因的深入研究[25-26,29-30],將為更進(jìn)一步解析病毒的功能提供依據(jù)。CPV毒力相關(guān)基因和決定宿主范圍的基因的鑒定以及其特性的研究,將會為全面理解宿主與病原之間的相互作用,為獲得新的更有效更特異檢測診斷方法以及重組疫苗的研制提供新的途徑。而對羊痘病毒更多復(fù)制非必需片段的篩選及更為有效的CPV載體的構(gòu)建,也必將為反芻獸的傳染病和其他動物疾病的控制產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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