李 寧,李 巍,王金鳳,張嶺嶺,孫繼國

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定071001)

豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起豬的一種急性病毒性傳染病,以腦炎、心肌炎和心肌周圍炎癥為主要特征。該病分布于世界各地,可引起多種動(dòng)物以及人類感染,危害極大。哺乳仔豬感染后,可發(fā)生急性致死性心肌炎,引起同窩和同圈的豬只感染,病死率高達(dá)100%。妊娠母豬感染后出現(xiàn)繁殖障礙,表現(xiàn)為流產(chǎn),產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等癥狀[1-2]。其它成年豬多呈隱性感染狀態(tài),給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失。豬腦心肌炎主要是豬和某些嚙齒類動(dòng)物的病毒性傳染病。家畜中以豬的感染最為嚴(yán)重,人及其他動(dòng)物也可感染發(fā)病。

當(dāng)前,豬腦心肌炎在世界多個(gè)國家均有流行,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。1945年首次從美國的佛羅里達(dá)州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內(nèi)分離到腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)。1960年,Murnane等人在巴拿馬從具有臨床癥狀的病豬體內(nèi)檢測(cè)到了EMCV,首次證實(shí)了該病毒對(duì)豬的感染性,之后該病在美國、意大利、澳大利亞、韓國等地也不斷被報(bào)道[3-4]。我國也于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到了EMCV,表明我國有豬腦心肌炎的存在。因此,開展對(duì)腦心肌炎的診斷與防制研究,不僅對(duì)防治豬腦心肌炎具有必要性,而且具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前,控制豬腦心肌炎最重要的手段依然是接種疫苗,國內(nèi)對(duì)該病尚無有效疫苗可預(yù)防,國外已有相應(yīng)的疫苗研制成功。因此,加強(qiáng)新型疫苗的研制具有重要的意義?，F(xiàn)將豬腦心肌炎疫苗的研究進(jìn)展介紹如下:

1 滅活疫苗

滅活疫苗是技術(shù)上最易實(shí)現(xiàn)且體液免疫效果較好的一種疫苗,也是目前應(yīng)用最為廣泛的疫苗之一。滅活疫苗使受種者產(chǎn)生以體液免疫為主的免疫反應(yīng),它產(chǎn)生的抗體有中和、清除病原微生物及其產(chǎn)生的毒素作用,對(duì)細(xì)胞外感染的病原微生物有較好的保護(hù)效果。Gomez等用了近5年的時(shí)間研制出豬用EMCV滅活疫苗,該疫苗安全、有效。最近,McLelland等在北非髯羊、印度羚、巖灰袋鼠和黑猩猩上評(píng)價(jià)了滅活疫苗的效果,在首免后1個(gè)月,所有免疫動(dòng)物均能產(chǎn)生較高水平的中和抗體,且持續(xù)達(dá)6個(gè)月二免后抗體水平持續(xù)升高,在12個(gè)月之后仍有較高的抗體水平[5]。以上研究證明滅活疫苗是便于推廣使用預(yù)防的首選疫苗。但滅活疫苗也有缺陷,如效率低而且保護(hù)期較短等,加強(qiáng)免疫佐劑、免疫程序等的相輔相承作用,能有效改善滅活疫苗保護(hù)效果。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗既可以產(chǎn)生體液免疫又能產(chǎn)生細(xì)胞免疫,但是弱毒疫苗僅適用于少數(shù)病原和免疫力低下的動(dòng)物。并且弱毒疫苗存在著毒力返強(qiáng)的可能。目前有關(guān)EMCV弱毒疫苗的報(bào)道相對(duì)較少,Bogaers W J C等[6]研究了弱毒疫苗的免疫效果,通過腹腔注射和豁膜免疫兩種途徑免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)免疫劑量與產(chǎn)生抗體的滴度呈線性相關(guān)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示,豁膜免疫產(chǎn)生的保護(hù)率比腹腔免疫的保護(hù)率要高,提示豁膜免疫對(duì)于抗感染具有重要意義。雖然弱毒疫苗可為機(jī)體免疫系統(tǒng)提供較好的保護(hù)力,但是傳統(tǒng)的弱毒疫苗存在毒力恢復(fù)的問題,具有一定的安全隱患。

3 活載體疫苗

由于活載體疫苗所表達(dá)的外源基因在機(jī)體內(nèi)隨載體(病毒)的復(fù)制而表達(dá),所以活載體疫苗具有與普通弱毒疫苗相似的優(yōu)點(diǎn)。與滅活疫苗相比,它用量少,接種方法簡單,不需要佐劑添加,從而大大降低了成本,而且免疫保護(hù)持續(xù)期長,免疫效果好。經(jīng)典的活載體是致弱的細(xì)菌或病毒,除誘導(dǎo)抗其自身免疫應(yīng)答外,還可作為載體表達(dá)其它病原體的免疫抗原。關(guān)于EMCV活載體的疫苗研究并不多。Choi B K等[7]EMC-D毒株的VPi基因克隆至牛結(jié)核分支桿菌中構(gòu)建重組活載體疫苗rBCG-VP1,在抵抗腹瀉型EMC-D的小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)中,達(dá)到100%的保護(hù)率。EMCV與FMDV同屬于微RNA病毒科的成員,在病毒基因組結(jié)構(gòu)上高度相似。FMDV基因工程疫苗的研究成果對(duì)于開展EMCV新型基因工程疫苗研究具有很好的借鑒作用。

4 亞單位疫苗

目前,科學(xué)家們正在研究同時(shí)針對(duì)不同病原的同時(shí)具有免疫原型和保護(hù)原性的疫苗。在生物科學(xué)領(lǐng)域有很多的抗原分子經(jīng)純化后可以在動(dòng)物模型上,甚至是自然宿主中引起免疫保護(hù)作用。亞單位疫苗只含有病原體的一種或幾種抗原,而不含有病原體的其他遺傳信息,因亞單位疫苗具有安全性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和無需滅活的優(yōu)點(diǎn)而倍受研究者的青睞。Jun H S等[8]克隆了EMCV的VP1基因,并插入到PRSET表達(dá)載體上,實(shí)現(xiàn)了VP1蛋白在大腸埃希菌中的高效表達(dá)。用純化的重組蛋白免疫小鼠,并用致糖尿病的EMCV-D株做攻毒保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組達(dá)到100%的保護(hù)率。由此可見,亞單位疫苗在的預(yù)防中具有較好作用。

5 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi),并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答,以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。目前,EMCV核酸疫苗的研究僅限于動(dòng)物試驗(yàn)階段。VP1蛋白是EMCV的主要抗原之一,可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,也是核酸疫苗構(gòu)建的主要候選基因。Sin J I等[9]用構(gòu)建表達(dá)EMCV-VP1蛋白和細(xì)胞因子GM-CSF的真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠,證實(shí)能夠刺激小鼠體內(nèi)有效抗體的產(chǎn)生,攻毒保護(hù)率達(dá)80%,而單獨(dú)用PCT-Gs-VP1免疫的小鼠在異源致死性EMCV的攻毒實(shí)驗(yàn)中保護(hù)率僅為43%。

6 基因缺失苗

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行毒株改造使之成為有效的疫苗。Duke等在研究中發(fā)現(xiàn),將門哥病毒的5'poly-c區(qū)段截短后能顯著的降低門哥病毒對(duì)小鼠的致病力。用這種改造過的病毒制備疫苗免疫小鼠,不僅能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體,而且能夠保護(hù)小鼠免受EMCV強(qiáng)毒的攻擊。隨后,Osorio等在非嚙齒類動(dòng)物上又對(duì)該疫苗的效果作了評(píng)價(jià),并與EMCV滅活疫苗進(jìn)行比較,結(jié)果基因缺失疫苗組在拂拂體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平要比滅活疫苗組高,組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)基因缺失疫苗在拂拂、短尾猿和豬體內(nèi)均不會(huì)引起病理性損傷,證明EMCV基因缺失疫苗適合多種動(dòng)物,并且安全有效。為了進(jìn)一步研究基因缺失疫苗的免疫效果,Backues G M等[10]將該疫苗應(yīng)用于髯猴、狐猴、合趾猴等數(shù)十種野生動(dòng)物,免疫后21 d測(cè)定中和抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)呈現(xiàn)多樣性,在免疫動(dòng)物中均未出現(xiàn)臨床癥狀,鑒于試驗(yàn)是在野生動(dòng)物園內(nèi)進(jìn)行,沒有進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),但從抗體水平上說明該疫苗可在多種野生動(dòng)物上適用。雖然研究顯示該疫苗具有很好的免疫原性,但作為疫苗,其在動(dòng)物發(fā)病后的抗感染作用及對(duì)懷孕母畜的安全性等問題還有待進(jìn)一步解決。

5 小結(jié)

通過各國科研人員的不斷努力,豬腦心肌炎疫苗的研究已經(jīng)取得重要的進(jìn)展,但還存在著以下亟待解決和關(guān)注的問題:①如何開發(fā)新型疫苗,以應(yīng)對(duì)當(dāng)前豬腦心肌炎病毒于環(huán)境中共存且變異的情勢(shì);②如何提高疫苗對(duì)豬腦心肌炎病毒的保護(hù)能力;③如何使新型疫苗在既重視獲得性免疫和天然免疫的情況下,又能很好地避免母源抗體的干擾。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和其它一些基礎(chǔ)學(xué)科的飛速發(fā)展,為疫苗的研究指明了新的方向,并且提供了相關(guān)的技術(shù)條件保證,特別是基因工程學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及其它一些新的技術(shù)為主體的現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展更是大大促進(jìn)了新型EMCV疫苗研究的步伐,EMCV新型疫苗設(shè)計(jì)理念的不斷涌現(xiàn),新型佐劑的加速開發(fā)和應(yīng)用,以及各種現(xiàn)有疫苗研究的進(jìn)一步深入,開發(fā)安全、有效的豬腦心肌炎疫苗將指日可待。

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