方艷紅,孫 裴,魏建忠,王桂軍,李 郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥230036)

沙門(mén)菌(Salmonella)有2500個(gè)以上的血清型,其中許多血清型菌株在人和動(dòng)物之間交叉感染,且大部分具有很強(qiáng)的致病性,對(duì)沙門(mén)菌的研究在畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生學(xué)上均有重要意義。沙門(mén)菌之所以能夠致病,是因?yàn)橛性S多毒力因子的存在,這些毒力因子包括脂多糖、腸毒素、細(xì)胞毒素以及毒力基因等。近年來(lái),隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,對(duì)沙門(mén)菌毒力基因的研究不斷深入。沙門(mén)菌具有質(zhì)粒和染色體毒力基因,其中大多數(shù)毒力基因由染色體上的毒力島編碼。本文就沙門(mén)菌毒力島、毒力質(zhì)粒上毒力基因的研究進(jìn)展做一綜述。

1 毒力島上毒力基因的研究

毒力島(pathogenicity island)是存在于病原菌染色體上的特定區(qū)域,編碼與毒力相關(guān)的基因。沙門(mén)菌的致病性主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一是侵入非吞噬細(xì)胞及其在細(xì)胞內(nèi)存活的能力,另一方面是在宿主的吞噬細(xì)胞中復(fù)制的能力。研究結(jié)果表明這些致病能力與沙門(mén)菌毒力島密切相關(guān)。目前,已發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌毒力島(salmonella pathogenicity island,SPI)大約有十幾個(gè)[1],即SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5等。

1.1 SPI1上毒力基因的研究

SPI1是全長(zhǎng)約為40 kb的DNA片段,位于沙門(mén)菌染色體63′處,其上游和下游分別為fhlA和mutS,G+C含量為42%,含有inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic等基因,編碼與侵襲力有關(guān)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的成分,但并非所有基因都與Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關(guān)。另外,在61′處還有一個(gè)單獨(dú)存在的sopE基因。

Sop蛋白是通過(guò)SPI1-Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)的,但是SopE和SopB蛋白卻由SPI1位點(diǎn)以外的基因編碼。sopE基因位于一個(gè)隱蔽的前噬菌體上,而sopB基因存在于SPI5毒力島上。SopE和SopB可轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,但它們可能有不同的作用。SopB有肌醇磷酸酯磷酸酶活性,可引起腹瀉癥狀,但與侵入無(wú)關(guān)。SopE與宿主細(xì)胞的侵入有關(guān),但sopE基因突變菌株侵襲力的不完全喪失,這表明可能還有其它與侵襲力有關(guān)的蛋白存在。最近還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)sopE類似物sopE2,它與sopE具有類似的作用[2]。

hilA是SPI1-Ⅲ型分泌系統(tǒng)的中心調(diào)節(jié)子,這個(gè)蛋白質(zhì)是含有屬于OmpR/ToxR家族DNA結(jié)合區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活因子。hilA直接控制inv/spa操縱子的表達(dá),且所有組成部分的產(chǎn)物都是分泌組織起作用所必須的。而hilA的表達(dá)直接由3個(gè)與araC相似的激活因子(HilC,HilD和RtsA)所控制,hilC,hilD和rtsA存在于hilA的上游。hilC、hilD和rtsA的缺失將導(dǎo)致hilA表達(dá)水平的降低[3]。對(duì)控制hilA表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究中,通過(guò)雙雜交試驗(yàn),證明hilE與hilD相連,并且表明hilE通過(guò)直接抑制hilD的功能來(lái)抑制hilA的表達(dá)。近來(lái)還有研究表明,AT P依賴性ClpXP蛋白酶可以通過(guò)控制鞭毛基因的表達(dá)來(lái)降低HilC、HilD的含量,從而抑制SPI1活化因子的表達(dá),最終抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[4]。

沙門(mén)菌入侵蛋白(Salmonella invasion proteins,Sips)是侵入過(guò)程的起始中心。已有研究表明,轉(zhuǎn)移蛋白酶SipB,SipC和SipD可以調(diào)節(jié)TTSS調(diào)節(jié)蛋白的傳遞。其中SipB蛋白的3-8片段是細(xì)菌細(xì)胞分泌物分泌所必須的,而且,結(jié)合在SipB碳末端80-100個(gè)氨基酸之間的sic對(duì)于確保SipB,SipC在細(xì)胞液中的穩(wěn)定性是非常重要的[5]。近來(lái)有研究表明,SipD在細(xì)菌接觸宿主細(xì)胞之前就存在于細(xì)菌表面,而SipB,SipC只有在細(xì)菌接觸宿主細(xì)胞之后才出現(xiàn)在細(xì)菌表面[6]。

對(duì)org、prg基因的研究表明,prgH,-I,-J或-K和orgA基因也存在于SPI-1,而且這些基因的產(chǎn)物可能是入侵分泌組織的重要組成部分。后來(lái)確定,orgA DNA序列的一個(gè)錯(cuò)誤將導(dǎo)致這個(gè)區(qū)域編碼兩個(gè)小的基因,而不是一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框。這些基因已被指定為orgA和orgB。此外,orgB的開(kāi)放閱讀框下游已確定并命名為orgC。還有文獻(xiàn)表示prgH,-I,-J和-K基因是轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子,而不同于下游基因orgA。為了更充分地描述這個(gè)入侵操縱,進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,prgH,prgI,prgJ,prgK,orgA和orgB基因都是入侵和分泌所必需的,而orgC不是入侵所必需的[7]。

1.2 SPI2上毒力基因的研究

SPI2全長(zhǎng)約40 kb,至少含40個(gè)基因,兩側(cè)是pyykF和valV tRNA基因。SPI2分為兩部分,一部分包含4個(gè)操縱子(ssa、ssr、ssc、sse),另一部分含有5個(gè)ttr基因(即ttrA、B、C和ttrR、S)。據(jù)報(bào)道,SPI2-Ⅲ型分泌系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上同SPI1-Ⅲ型分泌系統(tǒng)有別,該島可控制沙門(mén)菌在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,并使沙門(mén)菌逃逸巨噬細(xì)胞環(huán)氧合酶的殺傷作用[8]。

SPI2上的基因ssrA-ssrB編碼一個(gè)二元調(diào)節(jié)系統(tǒng),這個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包含一個(gè)膜約束傳感器激酶(SsrA)和一個(gè)同源反應(yīng)調(diào)節(jié)器(SsrB),且SsrB已被證明是沙門(mén)菌毒力基因的重要調(diào)節(jié)子。使用轉(zhuǎn)錄陣列分析SsrB協(xié)同調(diào)節(jié)基因發(fā)現(xiàn),有一個(gè)SsrB-高度依賴性基因srfN(ssrB-regulatedfactor N),SsrB能夠激活srfN基因,并直接控制srfN基因在細(xì)胞內(nèi)的感染[9]。此外,比較分析沙門(mén)菌ssrB基因突變菌株和野生菌株發(fā)現(xiàn),毒力基因sseL(STM2287,Salmonella secreted effector L)也受ssrB的控制[10]。

編碼底物蛋白的操縱子sse包括編碼轉(zhuǎn)移成分的基因sseB、sseC和sseD以及轉(zhuǎn)移蛋白SseF、SseG等,這些蛋白與耶爾森菌和腸致病性大腸埃希菌的底物蛋白相似。sseA碳末端區(qū)域可編碼一個(gè)具有形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)潛力的12.5 ku的蛋白,SseA不是一個(gè)分泌蛋白,而是SPI2依賴性轉(zhuǎn)移蛋白SifA和PipB所必需的。SifA與沙門(mén)菌在細(xì)胞胞漿內(nèi)的生存和復(fù)制密切相關(guān)。另外,SseA直接與SseB和SseD有關(guān),SseA是SseB和SseD的伴侶蛋白[11]。SseB、SseC和SseD是由SPI2-Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的存在于細(xì)菌表面的復(fù)合體,用來(lái)轉(zhuǎn)移Sse J等效應(yīng)蛋白,且與SPI2上效應(yīng)蛋白SspH1和SspH2轉(zhuǎn)移到感染細(xì)胞內(nèi)這一過(guò)程相關(guān)。SseB蛋白與真核細(xì)胞相互作用,SseB可以形成一個(gè)絲狀體將SPI2-Ⅲ型分泌系統(tǒng)連接到噬菌體膜上,且在感染試驗(yàn)中,在真核細(xì)胞片段上可以找到找到SseB蛋白[12]。

存在于SPI2上的基因ssa用來(lái)編碼T TSS結(jié)構(gòu)成分。研究證明SpiC(SsaB)蛋白能夠被轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),SpiC還影響內(nèi)體小泡在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和體外試驗(yàn)中的運(yùn)輸。而且,鼠傷寒沙門(mén)菌spiC突變體也表明在感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸液泡能力增強(qiáng)。重要的是,鼠傷寒沙門(mén)菌spiC突變體對(duì)小鼠的致病力以及在小鼠體內(nèi)的生存力均大大減弱。進(jìn)一步研究表明,spiC突變體與分泌基因突變體一樣,毒力都降低了,而且SpiC還是SPI2效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的,SpiC還可以分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SseB和SseC,但不分泌SseJ[13]。

1.3 其他SPI上毒力基因的研究

SPI3長(zhǎng)約17 kb,位于染色體81′處selC tRNA位點(diǎn)下游,含有10個(gè)開(kāi)放閱讀框,構(gòu)成6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。這些轉(zhuǎn)錄單元包含mgtCB操縱子,編碼高親和力Mg2+傳輸?shù)鞍踪|(zhì)和MgtC。其中mgtCBR基因的產(chǎn)物可介導(dǎo)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞和低Mg2+環(huán)境中存活。

SPI4長(zhǎng)約25 kb,位于沙門(mén)菌染色體下游92′處,其兩側(cè)為ssb(編碼單股DNA結(jié)合蛋白)和sox-SR(編碼過(guò)氧化物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白),含有18個(gè)開(kāi)放閱讀框。編碼介導(dǎo)毒素分泌Ⅲ型分泌系統(tǒng),并參與調(diào)節(jié)細(xì)菌適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

SPI5長(zhǎng)約7 kb,位于都柏林沙門(mén)菌染色體25′處,其兩側(cè)為serT和copS/copR位點(diǎn),G+C含量為43.6%,含有sop、sig、pip基因,編碼參與腸黏膜液體分泌和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白。

SPI6長(zhǎng)約59 kb,編碼safA 2D和tcsA 2R,引導(dǎo)伴侶蛋白調(diào)控菌毛操縱子;SPI7長(zhǎng)約134 kb,編碼Vi生物合成基因、sopE原噬菌體和ⅣB型菌毛操縱子;SPI8長(zhǎng)約6.8 kb,與pheVtRNA基因相連,編碼2種細(xì)菌素的偽基因(sty3280和sty3282)及整合酶的基因;SPI9長(zhǎng)約16 kb,與SPI4相似,編碼Ⅰ型分泌系統(tǒng)和獨(dú)立的Rtx2樣蛋白(Sty2875);SPI10長(zhǎng)約32.8 kb,存在于基因組的tRNA leuX上,含有sefC、sefR和sefB基因,編碼噬菌體和sefA 2R引導(dǎo)伴侶蛋白菌毛操縱子。

除上述這些較大的毒力島外,還有很多較小的基因插入?yún)^(qū)域以及與致病性有關(guān)的基因。

2 毒力質(zhì)粒spv的研究

以往的研究的認(rèn)為,在能夠引起嚴(yán)重全身感染的非傷寒沙門(mén)菌血清型中,普遍存在一大小約50-90kb的質(zhì)粒,該質(zhì)粒與沙門(mén)菌的毒力密切相關(guān),因此稱其為沙門(mén)菌毒力質(zhì)?！猻pv(Salmonella Plasmid Virulence)。但在國(guó)內(nèi),近來(lái)黃瑞等[14]的研究表明,傷寒沙門(mén)菌的某些耐藥質(zhì)粒上也含有spv。

研究表明不同血清型的沙門(mén)菌都含有一個(gè)約7.8 kb的與毒力相關(guān)的區(qū)域,即spv。spv基因含有spvR、spvA、spvB、spvC和spvD五個(gè)開(kāi)放閱讀框,位于這五個(gè)基因之后還有一個(gè)功能尚未完全清楚的orfE。目前已知spvR編碼LysR/metR家族轉(zhuǎn)錄活化因子的細(xì)菌調(diào)節(jié)性蛋白,并使基因按照合成SpvABCD的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。spvB編碼一大小為65 ku的單鏈多肽,spvA、spvC、spvD分別編碼大小為28.2 ku、28 ku、24.8 ku的蛋白質(zhì)。spv基因編碼的產(chǎn)物和細(xì)菌的毒力表型關(guān)系最為密切。已有實(shí)驗(yàn)研究表明,spv基因確實(shí)增加沙門(mén)菌在腸外組織細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng),并與細(xì)菌血清抗性、粘附與定居有關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),spv基因?yàn)榧?xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和生長(zhǎng)繁殖所必需的,毒力表現(xiàn)為細(xì)胞毒性,細(xì)菌增殖可致巨噬細(xì)胞分化和凋亡。

[1] Saroj S D,Shashidhar R,Karani M,et al.Distribution of Salmonella pathogenicity island(SPI)-8 and SPI-10 among different serotypes of Salmonella[J].Journal of Medical Microbiology,2008,57:95-102.

[2] Hapfelmeier S,Ehrbar K,Stecher B.Role of the Salmonella pathogenicity island 1 effector proteins SipA,SopB,SopE,and SopE2 in Salmonella enterica subspecies 1 serovar Typhimurium colitis in Streptomy cin-pretreated mice[J].Infect Immun,2004,72(2):795-809.

[3] Ellermeier C D,Ellermeier J R,Slauch J M.HilD,HilC and RtsA constitute a feed forward loop that controls expression of the SPI1 type three secretion system regulator hilA in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Mol Microbiol,2005,57:691-705.

[4] Kage H,Takay a A,Ohya M,et al.Coordinated regulation of expression of Salmonella pathogenicity island 1 and Flagellar T ypeⅢSecretion Systems by A TP-Dependent ClpXP Protease[J].J Bacteriol,2008,190(7):2470-2478.

[5] Kim B H,Kim H G,Kim J S,et al.Analysis of functional domains present in the N-terminus of the SipB protein[J].Microbiology,2007,153(9):2998-3008.

[6] María L T,Jorge E G.Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenicity island1-encoded TypeⅢsecretion system translocases mediate intimate attachment to nonphagocytic cells[J].Infect Immun,2009,77(7):2635-2642.

[7] Joanna R K,Thomas F F,Bradley D J.Transcriptional organization and function of invasion genes within Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenicity island 1,Including the prgH,prgI,prgJ,prgK,orgA,orgB and orgC Genes[J].Infect Immun,2000,68(6):3368-3376.

[8] Uchiya K,Nikai T.Salmonella entericaserovar Typhimurium infection induces cyclooxygenase 2 expression in macrophages:Involvement of Salmonella pathogenicity island 2[J].Infect Immun,2004,72(12):6860-6869.

[9] Suzanne E O,Don Walthers,Ana M T,et al.Pathogenic adaptation of intracellular bacteria by rewiring a cis-regulatory input function[J].Pans,2008,106(10):3982-3987.

[10] Brian K C,Michael J L,Jennifer L B,et al.SseL is a Salmonella-specific translocated effector integrated into the SsrB-controlled Salmonella pathogenicity island 2 TypeⅢsecretion system[J].Infect Immun,2007,75(2):574-580.

[11] Javier R A,Mundy R,Yu X J,et al.SseA is a chaperone for the SseB and SseD translocon components of the Salmonella pathogenicity island 2 encoded typeⅢsecretion system[J].Microbiology,2003,149:1103-1111.

[12] Wilson J W,Coleman C,Nickerson C A.Cloning and transfer of the Salmonella pathogenicityisl and 2 TypeⅢsecretion system for studies of a range of Gram-negative genera[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(18):5911-5918.

[13] Freeman J A,Rapple C,Kuhle V,et al.SpiC is required for translocation of Salmonella pathogenicity island 2 effectors and secretion of translocon protein SseB and SseC[J].J Bacteriol,2002,184(18):4971-4980.

[14] 黃 瑞,吳淑燕,聞?dòng)衩?傷寒桿菌耐藥質(zhì)粒pRs-m介導(dǎo)細(xì)菌毒力的研究[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2001,21(3):302-305.