劉曉燕 王 紅

(公安縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北 公安 434300)(湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

臨床檢驗技術(shù)發(fā)展及其在耐藥基因檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

劉曉燕 王 紅

(公安縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北 公安 434300)(湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

臨床檢驗技術(shù)；耐藥基因；分子生物學(xué)技術(shù)

一份準(zhǔn)確全面的醫(yī)學(xué)檢驗報告是醫(yī)生做出準(zhǔn)確診斷與制定正確治療方案必不可少的依據(jù)。因此，臨床醫(yī)學(xué)檢驗是一門極其重要的醫(yī)學(xué)學(xué)科。筆者對臨床醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r及新技術(shù)在細(xì)菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用作簡要綜述。

1 臨床檢驗技術(shù)的發(fā)展特點

20世紀(jì)40年代前，我國醫(yī)學(xué)檢驗基本上為一片空白，大多數(shù)醫(yī)院未設(shè)立專業(yè)的檢驗科室或只是開展極其簡單的檢驗項目。50年代才開始有醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)。1982年，我國正式成立衛(wèi)生部臨床檢驗中心，為國內(nèi)外臨床檢驗質(zhì)量控制方法和質(zhì)量管理經(jīng)驗交流建立了平臺，使國內(nèi)的臨床檢驗走上了規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的道路。

近二十年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和計算機(jī)技術(shù)的廣泛滲透，最新的生物技術(shù)和生物信息研究成果不斷地進(jìn)入到臨床實驗室?，F(xiàn)代臨床檢驗技術(shù)主要有以下特點。

1.1檢驗技術(shù)操作的自動化程度日益提高現(xiàn)代臨床檢驗醫(yī)學(xué)已經(jīng)從以前的手工操作和簡單的生化測試方法，轉(zhuǎn)變成今天的全自動化設(shè)備，能夠檢測多種生化、免疫等指標(biāo)，并能檢測疾病相關(guān)基因，成為一門涉及多領(lǐng)域的學(xué)科。在現(xiàn)代臨床檢驗實驗室中，全自動生化測試儀、全自動血細(xì)胞分析儀、自動凝血儀、自動免疫測試儀、質(zhì)譜儀等已經(jīng)成為不可缺少的組成部分。現(xiàn)代化儀器的使用，加快了臨床檢驗發(fā)展的速度，提高了準(zhǔn)確率和精確度，同時減輕了工作人員的勞動強(qiáng)度。

1.2免疫標(biāo)記技術(shù)、熒光技術(shù)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展80年代后期至90年代，免疫比濁測定、凝集試驗、沉淀試驗發(fā)展到免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、酶免疫試驗、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、膠體金和膠體曬免疫技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、蛋白質(zhì)芯片、蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜和流式細(xì)胞技術(shù)紛紛應(yīng)用于臨床，大大提高了檢測靈敏度和檢測范圍。

20世紀(jì)中期開始,分子生物學(xué)拉開序幕，從DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn),限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用,到DNA測序方法的成熟和PCR技術(shù)的誕生,分子生物學(xué)的發(fā)展使生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷進(jìn)入了一個新的時代[1]。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在耐藥基因檢測和定位中的應(yīng)用

2.1聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種快速在體外從某種來源的模板DNA中擴(kuò)增目標(biāo)DNA的通用方法，是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一?？捎迷摷夹g(shù)對細(xì)菌核酸內(nèi)已知的耐藥性基因進(jìn)行篩查和驗證。利用商品試劑盒從細(xì)菌中抽提的基因組、質(zhì)粒，純度和濃度均很高，可作為穩(wěn)定的DNA模板，通過挑取菌落煮沸裂解直接得到細(xì)菌DNA模板，方便快捷，適合大批量地進(jìn)行耐藥基因篩查[2]。引物的特異性以及擴(kuò)增體系和條件對于PCR的特異性和敏感性非常重要，每次實驗中均應(yīng)包含陽性對照樣本和陰性對照樣本。

2.2核酸雜交核酸雜交(molecular hybridization)是分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究工具，利用的是單鏈核酸分子間能退火形成雙鏈分子(也就是雜交)的能力。能形成雙鏈分子的單鏈分子間必須有高度的堿基互補(bǔ)配對。通常是利用一段被標(biāo)記的核酸分子作為探針(probe)，在許多未經(jīng)標(biāo)記的核酸分子混合物中鑒別同源DNA或RNA分子。

通常將細(xì)菌菌落直接轉(zhuǎn)移到濾膜上雜交，探針可采用同位素、地高辛或者生物素標(biāo)記。核酸雜交還可以用于耐藥基因定位。將細(xì)菌抽提出的質(zhì)粒通過瓊脂凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜并用特異性耐藥基因探針進(jìn)行雜交，觀察質(zhì)粒在電泳圖上的位置是否存在雜交信號可以判斷該耐藥基因是否定位于質(zhì)粒[3]。

2.3酶切克隆PCR和核酸雜交只能對已知的耐藥基因進(jìn)行篩查和驗證，如果需要尋找未知的耐藥基因，可以利用酶切克隆和抗生素篩選的方法。通常對于具有抗生素耐藥表型的細(xì)菌，首先挑選合適的片段連接入載體(如質(zhì)粒，噬菌體)，通過該耐藥表型抗生素篩選重組子可以獲得攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，最后對所獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測序，明確耐藥基因的具體信息[4]。實驗的關(guān)鍵點是所挑選的內(nèi)切酶必須有比較合適的切點，即酶切片段大小要適中，片段太長不易連接入載體，而片段太短則不能包含完整的基因序列，導(dǎo)致缺乏耐藥表型[5]。

2.4全基因組測序隨著測序技術(shù)在近幾年的飛速發(fā)展，獲得一個物種的全基因組序列已經(jīng)不是非常困難的事情，特別是相對簡單的細(xì)菌基因組。明確耐藥株的核酸全序列之后，可以在基因組的水平對基因分布、代謝途徑、調(diào)控通路有一個全局性認(rèn)識，特別是可以明確耐藥基因的進(jìn)化和傳播機(jī)制，深入了解目前廣泛存在的細(xì)菌泛耐藥問題。比較傳統(tǒng)的方法是先構(gòu)建全組基因組DNA文庫，利用載體克隆大量的文庫DNA片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序，再將測序片段進(jìn)行拼接以獲得完整的基因組全長[6]。

近兩年來，基于芯片技術(shù)的新的全基因組測序技術(shù)也已興起。Smith等[7]運(yùn)用此技術(shù)成功地完成了全長3976746個堿基對的鮑曼不動桿菌基因組測序工作。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用日益廣泛，將對揭示細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及流行的分子機(jī)制，控制耐藥細(xì)菌流行播散發(fā)揮日益強(qiáng)大的作用。

[1]許敏.美國臨床檢驗醫(yī)學(xué)進(jìn)展的借鑒[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，28(2)：182-184.

[2] Cattoir V，Poirel L，Rotimi V，etal.Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterbacterial isolates[J]. J Antimicrob Chemother，2005，49：3091-3094.

[3] Poirel L，Van De Loo M，Mammeri H，etal.Association of beta-lactamase VEB-1[J]. AntimicrobAgents Chemother，2005，49：3091-3094.

[4] Hata M，suzuki M， Matsumoto M，etal.Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in shigella flexneri 2b[J]. Antimicrob Agents Chemother，2005，49：801-803.

[5] 俞去松. 分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(6)：610-613.

[6] Jin Q，Yuan Z，Xu J，etal.Genenome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichiacoli K12 and O157[J].Nucleic Acides Res，2002，30：4432-4441.

[7]Smith MG，Gianoulis TA，Pukatzki S，etal.New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis reveald by high-density pyrosequencing and transposo mutagenesis[J].Genes Dev，2007，21：601-614.

[編輯] 一 凡

R446.1

A

1673-1409(2010)02-R075-02

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.02.033

2010-02-28

劉曉燕(1975-)，女，湖北公安人，主管技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗工作。