柯 霞綜述,洪蘇玲審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 400016)

鼻咽癌是中國最常見的頭頸部腫瘤之一,發(fā)病率逐年增長,具有明顯的地域性。在其多因素的發(fā)展過程中,遺傳易感性、EB病毒和環(huán)境因素被認為是主要原因。鼻咽癌的發(fā)病機制、腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤機制、中晚期及復發(fā)、轉(zhuǎn)移患者更為有效的治療方式的探尋等都成為廣大研究者有待解決的問題。隨著轉(zhuǎn)基因、基因敲除等技術(shù)在實驗動物模型中的廣泛應用,建立理想的鼻咽癌動物模型,成為解決上述問題的關(guān)鍵之一。1969年Rygaard和Povlsen[1]首次成功將人類結(jié)腸癌移植于裸鼠,開辟了利用動物研究人類腫瘤的廣闊前景。到目前為止,針對多種疾病已積累了大量的動物模型,近年來還開始應用基因改變動物模型,并已用于腫瘤防治的研究。

已報道的研究鼻咽癌的動物模型主要分以下幾類:誘發(fā)性鼻咽癌動物模型、移植性鼻咽癌動物模型、轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼻咽癌動物模型、鼻咽癌轉(zhuǎn)移動物模型等?，F(xiàn)介紹以上模型的生物學特性及在鼻咽癌研究中的應用情況。

1 誘發(fā)性鼻咽癌動物模型

誘發(fā)性鼻咽癌動物模型是指用化學、物理或生物的致癌因素作用于動物而形成的鼻咽癌模型。二甲基膽蒽(methy lcholanthrene,MC)、二乙基亞硝胺(diethy lnitrosam ine,DEN)、二亞硝基哌嗪(dinitrosopiperazine,DNP)都曾用于誘發(fā)大鼠鼻咽癌。MC誘發(fā)癌癥概率可達60%以上,但是所需時間較長。陳主初[2]利用DNP對鼻咽上皮的高組織親和性,通過少量多次或短期大量皮下注射、鼻咽局部給藥途徑,均引起鼻咽上皮癌變,并2次作用于體外培養(yǎng)的人胚鼻咽上皮并使其惡性轉(zhuǎn)化。孫寧等[3]利用DNP進行皮下注射,誘導鼻咽上皮癌變,發(fā)現(xiàn)在化學誘癌過程中,不同階段鼻咽上皮病變動態(tài)變化時,底層細胞、鱗狀上皮細胞、柱狀上皮細胞的非典型增生與癌變呈高度正相關(guān),并隨動物存活時間的延長而增多。

2 移植性鼻咽癌動物模型

移植性鼻咽癌動物模型是指將鼻咽癌組織或細胞移植于實驗動物而培養(yǎng)出的模型。移植方式包括腫瘤組織塊接種、組織塊懸液注射、腫瘤細胞懸液注射等。實驗動物多采用胸腺缺失裸鼠和嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immun deficiency,SCID)小鼠。這是近年來最常見的鼻咽癌模型,目前特征明確,廣泛應用的鼻咽癌癌細胞株有多種,如 CNE-1、CNE-2、5-8-EGFP等。移植部位常選擇腋下或背部接種。李智等[4]建立了鼻咽癌細胞株CNE-1、CNE-2移植瘤動物模型,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的主要死亡途徑是凋亡,這種凋亡可能是bax介導的,而非p53依賴性的。唐慰平[5]將CNE-2Z細胞株接種于裸鼠皮下成瘤,并觀察其生物學特性,發(fā)現(xiàn)腫瘤具有易發(fā)生局部浸潤,淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移等特點。黃培根等[6]將人鼻咽癌活檢組織接種于裸小鼠,原代移植成功后,取瘤塊進行鼠間移植,所得腫瘤保持了人低分化鼻咽鱗癌的組織學及超微結(jié)構(gòu)特點,但此移植瘤生長較緩慢,腫瘤無明顯局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移等生長改變。文慶蓮等[7]比較了幾種常用的皮下移植瘤的造模方法,發(fā)現(xiàn)新鮮組織塊成瘤率最高,成瘤潛伏時間短,腫瘤體積倍增時間短,但由于種植的組織塊大小很難保證一致,故成瘤后體積也欠均一;細胞懸液接種法成瘤率約為88%,成瘤潛伏時間較長,但是可以對接種細胞數(shù)進行定量,所得腫瘤體積均勻,適用于體積一致性要求較高的實驗;凍存組織在復蘇后仍能成瘤,其成瘤率高于組織細胞勻漿法,可用于需要保存標本的實驗。

近年來將穩(wěn)定表達熒光素酶的腫瘤細胞原位或異位移植到動物中,通過活體熒光成像技術(shù),觀察腫瘤的生長和早期轉(zhuǎn)移情況,為腫瘤生長的示蹤和治療效果的評價奠定基礎(chǔ)[8-10]。Liu等[11]將5-8F-GFP和6-10B-GFP細胞株直接注射到裸鼠鼻咽部或異位種植到裸鼠皮下,可視化觀察原位腫瘤的生長情況以及血管生成和轉(zhuǎn)移,發(fā)現(xiàn)與人鼻咽癌特性一致,具有高轉(zhuǎn)移活性的5-8F株能引起腦、頸淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移,而皮下移植瘤均未見轉(zhuǎn)移發(fā)生,這一結(jié)果表明,如同“種子-土壤”假說那樣,腫瘤的轉(zhuǎn)移與細胞型別和宿主微環(huán)境密切相關(guān),提示原位可視化鼻咽癌動物模型在闡明鼻咽癌生長、發(fā)生、轉(zhuǎn)移和血管生成方面有著極其重要的意義。孫寶昌等[12]將表達熒光素酶基因的真核表達載體轉(zhuǎn)入肝癌細胞,再將穩(wěn)定表達熒光素酶的肝癌細胞接種到裸鼠皮下成瘤,利用活體成像系統(tǒng)觀察了腫瘤的生長過程。M ocanu等[13]將熒光、生物發(fā)光和成像技術(shù)聯(lián)合起來,系統(tǒng)檢測了腺病毒在鼻咽癌移植瘤中的攝入情況,為監(jiān)測腫瘤腺病毒基因治療中的轉(zhuǎn)移情況提供了新方法。但具體應用到人鼻咽癌的相關(guān)研究尚無相關(guān)文獻報道,這將可能成為鼻咽癌動物模型研究的新方向。

3 轉(zhuǎn)基因和基因敲除鼻咽癌動物模型

轉(zhuǎn)基因動物是指用人工的方法將外源目的基因或特定的DNA片段導入宿主動物體內(nèi),使之在宿主基因組中穩(wěn)定整合而得以表達,并能遺傳給后代的一類動物。轉(zhuǎn)基因動物建立的方法有多種,包括顯微注射技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)、胚胎干細胞技術(shù)、精子載體技術(shù)等。1990年Wilson等[14]用EB病毒的 LMP1與多瘤病毒或免疫球蛋白重鏈基因(Eμ)的調(diào)控區(qū)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因,建立了轉(zhuǎn)基因模型,所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠在皮膚和黏膜(包括鼻黏膜)均出現(xiàn)過度角化。何迎春等[15]利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含突變型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表達載體p LMP1-p53m t,采用顯微注射法將線性化的表達載體注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后將注射存活的受精卵植入假孕母鼠的輸卵管,取其產(chǎn)3周齡子代鼠進行篩選,成功構(gòu)建了含突變型p53和EB病毒LMP1基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,此模型表現(xiàn)出鼻咽黏膜上皮灶性增生特征,為鼻咽癌前病變機制的研究提供了新的手段。張玲等[16]采用 EDL-2、PLUNC-p雙啟動子調(diào)控鼻咽癌來源的LM P1的表達載體,成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,在轉(zhuǎn)基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位均檢測到了外源基因的表達,但是未觀察到鼻咽組織有明顯的病理改變。藍珂等[17]利用顯微注射技術(shù),制備出鼻咽癌來源LMP1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,在單一干預因素下導致鼻咽不典型增生,首次說明了LMP1扮演了癌變始動因素這一角色,為整體上研究LMP1在鼻咽癌變過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。呂麗春等[18]將角質(zhì)上皮特異性啟動子ED-L2調(diào)控的多聚免疫球蛋白受體(pIgR)基因用顯微注射方法將其導入受精卵中,使該基因能在F0代轉(zhuǎn)基因鼠鼻咽部特異性表達,所構(gòu)建的攜帶有p IgR的轉(zhuǎn)基因鼠,使其能以近乎自然的狀態(tài)感染EBV,為研究EBV與鼻咽癌的關(guān)系提供了最直接的依據(jù)。轉(zhuǎn)基因或基因敲除鼠模型中腫瘤生長和發(fā)展快速,可以比較方便地獲得腫瘤發(fā)展的整個過程,因此主要用于腫瘤轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生中基因生物學功能的研究。然而,基因敲除技術(shù)仍存在不少問題,如成功率低、敲除基因的功能可能被其他基因代償性填補等,尚需進一步研究。

4 鼻咽癌轉(zhuǎn)移動物模型

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學特性之一,研究轉(zhuǎn)移是腫瘤研究的一個重要領(lǐng)域,對臨床治療具有指導意義[19]。根據(jù)途徑不同分為實驗性轉(zhuǎn)移和自發(fā)性轉(zhuǎn)移。實驗性轉(zhuǎn)移適合研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)移后期階段的著床、生長、血管生成等;自發(fā)性轉(zhuǎn)移能再現(xiàn)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的全過程,是較為理想的鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移模型。由于鼻咽解剖部位的隱蔽性和鼻咽癌臨床癥狀的多樣性,盡管早期篩查已廣泛應用于臨床,但多數(shù)患者在就診時已處于中、晚期,故針對鼻咽癌易出現(xiàn)淋巴結(jié)、肝、肺、骨轉(zhuǎn)移的情況,建立鼻咽癌轉(zhuǎn)移動物模型,同時,研究鼻咽癌的定向轉(zhuǎn)移情況也尤為重要。目前,在腫瘤定向轉(zhuǎn)移的研究中,利用免疫缺陷動物體內(nèi)傳代的方法篩選出不同器官親和性的轉(zhuǎn)移瘤細胞亞株,并通過觀察轉(zhuǎn)移的特異性和相關(guān)影響因素來探討腫瘤特定器官轉(zhuǎn)移的機制,是較重要的手段之一[20]。韓春等[21]用標記綠色熒光蛋白的鼻咽低分化鱗癌細胞株5-8F-EGFP作為母系,接種于裸鼠脾臟,觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況,并取肝臟轉(zhuǎn)移灶做原代培養(yǎng),得到了肝轉(zhuǎn)移亞群5-8F-H 3B-EGFP,其侵襲性、運動性以及形成肝轉(zhuǎn)移灶的能力均大于母系,具有較高的肝臟親和性,為進一步研究鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移的機制、動態(tài)觀察腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況提供了良好的動物模型。黃劍等[22]將鼻咽癌細胞株CNE-2Z-H 5移植于裸鼠皮下,取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細胞再次移植于裸鼠皮下傳代,連續(xù)傳代,發(fā)現(xiàn)各代裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率不斷升高,而肺轉(zhuǎn)移率一直穩(wěn)定在較低水平,成功建立了人鼻咽癌自發(fā)性高淋巴道轉(zhuǎn)移模型,并篩選出單一淋巴道轉(zhuǎn)移途徑的腫瘤細胞亞群。李曉華等[23]通過門靜脈或肝包膜下注射鼻咽癌細胞株細胞懸液,建立了鼻咽癌細胞株肝異位種植瘤肺轉(zhuǎn)移裸鼠動物模型,發(fā)現(xiàn)門靜脈及肝包膜下注射兩種途徑在成瘤率、腹水形成率、肺轉(zhuǎn)移率上均無明顯差別,兩種方法都能成功構(gòu)建鼻咽癌異位種植瘤模型。Leng等[24]用鼻咽癌細胞株5-8F-EGFP建立了穩(wěn)定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可視化裸鼠模型,篩選獲得了具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的細胞株5-8F-LN,并證實了IRF1在鼻咽癌的演進過程中起重要作用,而CAV1在5-8F-EGFP中的高表達可能和其高轉(zhuǎn)移特性有關(guān)。

黃江瓊等[25]將VX2瘤細胞株荷瘤新西蘭兔剝離腫瘤,CT引導下將瘤細胞懸液注入兔鼻咽部,建立了兔鼻咽VX2移植瘤動物模型,腫瘤形成后向周圍迅速浸潤性生長,頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高,晚期可出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移,這與人鼻咽低分化鱗癌的生長過程類似,是目前報道的研究人類鼻咽癌較理想的動物模型。

綜上所述,現(xiàn)有的鼻咽癌動物模型都有其自身的優(yōu)點和缺點,原位誘發(fā)性動物模型因成功率低、周期長而較少應用;皮下種植腫瘤建模具有操作簡單、成瘤率高、易于觀察等優(yōu)點而應用較多,但也存在腫瘤易形成包膜、不容易轉(zhuǎn)移、且腫瘤中央易缺血性壞死等缺點[26]。動物實驗是基礎(chǔ)科研應用于臨床的關(guān)鍵所在,在疾病的多因素、多階段發(fā)展過程中,每種特定的動物模型都只能反映其極少一部分,因此,在實驗過程中,應該針對實驗目的,結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,合理選擇和利用動物模型。

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