沈紫微,陳本建,康俊梅,魏小蘭,張?zhí)N薇

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,北京 100193）

隨著航天技術(shù)的發(fā)展,空間生命科學(xué)的研究逐漸引起科學(xué)家的重視。我國(guó)從20世紀(jì)80年代才開(kāi)始用返回式衛(wèi)星和高空氣球搭載種子進(jìn)行航天誘變育種研究。1987年我國(guó)在發(fā)射的第9顆返回式衛(wèi)星上首次進(jìn)行了將蔬菜等農(nóng)作物種子搭載上天的試驗(yàn)[1]。20世紀(jì)90年代以后報(bào)道[2-6]日趨增多。許多科技工作者通過(guò)航天搭載和地面選育相結(jié)合選育出了一批優(yōu)良新品種[7-9],證實(shí)航天育種在新品種選育方面具有十分廣闊的前景,是創(chuàng)造新突變型的一條新途徑。

紅豆草（Onobrychis viciaefolia）是豆科紅豆屬多年生草本植物,原產(chǎn)于歐洲,在我國(guó)許多地方引種栽培,效果良好。其適生于酸性土壤的森林草原,抗旱性、抗寒性和抗病蟲(chóng)害能力均較強(qiáng)。由于其富含蛋白質(zhì)、氨基酸,且粗脂肪、鈣和磷含量較高,莖葉繁茂,草質(zhì)柔軟,為各類(lèi)家畜和家禽所喜食,因此具有“牧草皇后”的美譽(yù)。除此之外,紅豆草根系極為發(fā)達(dá),根瘤菌較多,對(duì)改良土壤有重要作用[10]。然而,目前對(duì)紅豆草的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)所知甚少。

作為眾多新型分子標(biāo)記技術(shù)中的一種,簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simple sequence repeatI,SSR）,是由Zietkiewicz等[11]1994年提出的微衛(wèi)星分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分子標(biāo)記,用于檢測(cè)SSR間DNA序列差異。雖然ISSR技術(shù)提出時(shí)間不久,但已廣泛應(yīng)用于包括草業(yè)在內(nèi)的很多領(lǐng)域。2005年Mcroberts等[12]用 ISSR對(duì)4個(gè)印度哈里亞納邦一年生的某雜草種子進(jìn)行多態(tài)性分析。2007年肖海峻和徐柱[13]用ISSR技術(shù)研究了90份鵝觀草（Roegneria klamojii）材料,發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性指數(shù)的大小與其所處生境的緯度、海拔高度和年均降雨量的相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著。2007年Li等[14]用4種分子標(biāo)記方法對(duì)中國(guó)東北的松嫩平原上的野大麥（Hordeum brevisubulatum）品種進(jìn)行了多態(tài)性分析。另外,有關(guān)ISSR的分子標(biāo)記技術(shù)在冰草屬（Agropyron）和雀麥屬（Bromus）中也有所應(yīng)用[15]?？梢?jiàn),ISSR標(biāo)記是揭示植物遺傳多樣性,進(jìn)行QTL定位和分子作圖的有效手段。但到目前為止,除有關(guān)于航天搭載紅豆草生理生化變異方面研究[16]的報(bào)道外,運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)研究航天搭載紅豆草遺傳物質(zhì)變異情況鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以航天搭載的紅豆草種子播種的植株為試驗(yàn)材料,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)紅豆草ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化分析,并對(duì)53個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選,以期獲得適合于紅豆草的ISSR反應(yīng)體系；同時(shí)利用已優(yōu)化好的ISSR體系及篩選出的引物對(duì)航天搭載及對(duì)照材料進(jìn)行分子標(biāo)記,檢測(cè)在空間環(huán)境影響下航天搭載材料的基因組DNA的變異情況,以期為今后構(gòu)建紅豆草ISSR圖譜奠定基礎(chǔ),對(duì)今后深入研究紅豆草航天誘變機(jī)理提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用紅豆草材料來(lái)自北京海淀區(qū)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)地。2006年精選紅豆草種子,一部分搭載“實(shí)踐八號(hào)”育種衛(wèi)星,于9月9日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心升空,衛(wèi)星在近地點(diǎn)187 km、遠(yuǎn)地點(diǎn)463 km的近地軌道運(yùn)行,于9月24日返回地面。另一部分貯存于地面常溫條件下,作為對(duì)照。于2008年溫室育苗,移栽于試驗(yàn)地。2009年9月選取紅豆草變異單株75株及地面對(duì)照14株,采集幼嫩葉片作為供試材料。用冰盒迅速帶回,放置于-20℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA的提取和檢測(cè)采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bro-mide,CTAB）法提取基因組DNA,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度,最后將樣品質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μ L,置于-20℃冰箱保存。其中75株變異植株采用單株提取DNA的方式,對(duì)照植株按單株提取DNA的方式提取了田間14株普通植株葉片。

1.3ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia,UBC）所設(shè)計(jì)的ISSR通用引物,其中808號(hào)引物適合于多種植物,以其為固定引物進(jìn)行反應(yīng)體系的構(gòu)建[17-21]。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17-20]的ISSR-PCR反應(yīng)體系,首先對(duì)dNTP、引物濃度、Taq酶濃度、Mg2+濃度進(jìn)行4因素 3水平的探索正交試驗(yàn)（表 1、表2）,再根據(jù)探索正交試驗(yàn)的結(jié)果縮小各個(gè)因素的濃度梯度,進(jìn)行細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)。除表中變化因素外,每管（25 μ L體系）中還含有 1×buffer和 50 ng模板DNA,試驗(yàn)設(shè)2次重復(fù),取對(duì)照植株葉片DNA作供試樣本。ISSR引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,dNTP及TaqDNA聚合酶均購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

表1 探索正交試驗(yàn)水平—因素

表2 探索正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表-L9（34） μ L

1.4PCR反應(yīng)程序利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建適合紅豆草的ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200（MJ Research Peltier T hermal Cycler,USA）PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸2 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸4 min,然后置于4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,取5.0 μ L 擴(kuò)增產(chǎn) 物,加入 1.0 μ L 上 樣緩沖液（6%溴酚藍(lán)）,然后在2%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣,5 V/cm電泳1～1.5 h,最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)）上觀察并照相。

1.5引物篩選與最佳退火溫度的確定在已優(yōu)化好的體系的基礎(chǔ)上篩選引物及最佳退火溫度。所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)公司公布的ISSR引物序列[22],從相關(guān)文獻(xiàn)中找出較為適合紅豆草的53個(gè)引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增篩選,選出擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物,由上海生物工程公司（Sangon）合成。然后針對(duì)篩選出的引物,使用 T-Gradient（Biometra）梯度 PCR儀,對(duì)各個(gè)引物進(jìn)行最佳退火溫度的篩選。試驗(yàn)設(shè) 12 個(gè)退火溫度梯度 :46.0、46.3、47.3、48.8、50.5、52.2、53.8、55.5、57.2、58.7、59.7和 60.0 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析電泳圖譜中的每一條帶均為1個(gè)分子標(biāo)記,代表在模板上有1個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn),對(duì)凝膠上的帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),按照電泳圖譜中同一位置上帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有帶的記為1,無(wú)帶的記為0,獲得二元數(shù)據(jù)矩陣。利用 POPGENE32軟件[23]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）,Nei基因多樣性指數(shù)（h）,Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1ISSR-PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化

2.1.1ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的探索性正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 各處理組合結(jié)果具有明顯差異。1、3號(hào)處理均有1個(gè)重復(fù)未擴(kuò)增出條帶,2號(hào)處理擴(kuò)增條帶不清晰,5、8、9號(hào)處理重復(fù)性不太好,說(shuō)明這些組合反應(yīng)體系穩(wěn)定性不高或不適宜組合（圖1）。可能由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)因素梯度較大 ,有些處理偏離最優(yōu)組合較遠(yuǎn)。但4、6、7號(hào)處理組合,尤其是4號(hào)處理組合重復(fù)性好,條帶多且清晰（圖1）,說(shuō)明距最優(yōu)組合偏差不大。再以其為基點(diǎn),縮小各個(gè)因素的濃度梯度進(jìn)行細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)。

2.1.2ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)的各因素濃度范圍調(diào)整為dNTP 0.1～0.3 mmol/L,Taq酶0.5～2.5 U,Mg2+2.0～3.0 mmol/L,引物 0.2～0.4 μ mol/L。結(jié)果顯示,每一處理組合基本都可擴(kuò)出數(shù)條條帶。其中1、2、3和 9號(hào)條帶較弱,且多態(tài)性不高；4、6、9號(hào)處理重復(fù)性不好,說(shuō)明其反應(yīng)體系不太穩(wěn)定。試驗(yàn)效果最好的是5和8號(hào)處理組合,擴(kuò)增條帶較清晰、重復(fù)性也好,為最佳的處理組合（圖2）。

圖1 ISSR-PCR探索正交試驗(yàn)結(jié)果

圖2 ISSR-PCR細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)結(jié)果

參照張麗等[24]的方法,對(duì)各組分濃度組合的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了正交直觀統(tǒng)計(jì)分析（表3）,結(jié)果顯示,在選定的3個(gè)水平范圍內(nèi),Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響依次為引物＞dNTP＞TaqDNA聚合酶＞Mg2+。從最佳濃度確定值結(jié)果來(lái)看,dNTP以水平2好,Taq DNA聚合酶以水平2好,引物以水平3好,Mg2+以水平3好,由此可得最佳理論處理組合為:dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶1.5 U 、引物0.4 μ mol/L 、Mg2+3 mmol/L 。

該組合與細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)結(jié)果選出的最佳組合5最接近,僅Mg2+的濃度有差異,其他各組分濃度均一致；其次與組合8也較接近,二者的Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶濃度均一致,僅dNTP和引物存在差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,將該理論組合與5號(hào)及8號(hào)處理組合進(jìn)行比較,所用的DNA模板為隨機(jī)選取的6份誘變材料DNA。結(jié)果顯示（圖3）,這3個(gè)擴(kuò)增體系條帶基本一樣,但5號(hào)組合擴(kuò)增出的有些條帶明顯較亮,且擴(kuò)增條帶數(shù)較多。因此,進(jìn)一步確定組合5為最優(yōu)組合,選用其為正式試驗(yàn)的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

表3 ISSR-PCR細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

圖3 3種反應(yīng)體系結(jié)果的比較

2.2 引物及其最佳退火溫度的篩選對(duì)53個(gè)引物進(jìn)行篩選,最終篩選出12個(gè)條帶清晰,多態(tài)性較好的引物,同時(shí)確定了各引物的最佳退火溫度（表4）,部分結(jié)果見(jiàn)圖 4、5。在這 12條引物中（AG）n有5條,（GA）n有1條,（AC）n有2條,說(shuō)明紅豆草基因組中存在大量的（AG）、（GA）、（AC）二核苷酸重復(fù)序列。

2.3ISSR初步分析遺傳多樣性利用已優(yōu)化好的紅豆草ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析,經(jīng)過(guò)12個(gè)引物擴(kuò)增,記錄的條帶大小范圍為300～1 000 bp,共獲得193個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)（表5）,其中多態(tài)性位點(diǎn)142個(gè),多態(tài)性比率為73.6%,每個(gè)引物的擴(kuò)增位點(diǎn)為10～23個(gè),平均16.1個(gè),其中多態(tài)性位點(diǎn)7～18個(gè),平均11.8個(gè),部分結(jié)果見(jiàn)圖6。

表4 引物及最佳退火溫度篩選結(jié)果

圖4 引物834最佳退火溫度的確定

圖5 引物836最佳退火溫度的確定

圖6 引物UBC808對(duì)紅豆草部分樣品基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

為了進(jìn)一步分析搭載和對(duì)照之間遺傳變異的差別,在75株變異單株中隨機(jī)抽取14株,與14株對(duì)照植株一起獲得搭載植株與對(duì)照植株的二元數(shù)據(jù)矩陣,利用POPGENE32軟件分析。航天誘變植株多態(tài)位點(diǎn)百分率為（P）68.60%,Nei基因多樣度為0.374 3,Shannon多樣性指數(shù)為0.555 6；而地面對(duì)照多態(tài)位點(diǎn)百分率為41.50%,Nei基因多樣度為0.256 8,Shannon多樣性指數(shù)為0.414 7,均低于航天誘變種,表明航天誘變?cè)黾恿思t豆草遺傳變異。

表5 ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

空間環(huán)境中的強(qiáng)輻射、微重力和超真空等特殊環(huán)境可引起植物及其后代發(fā)生變異,包括形態(tài)學(xué)變異、細(xì)胞學(xué)變異、生理生化變異及遺傳物質(zhì)的變化等[25]。ISSR是由SSR（simple sequence repeats）發(fā)展而來(lái)的一種新的分子標(biāo)記,操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)結(jié)果方便,并具有SSR的穩(wěn)定性,比RAPD具有更高的多態(tài)性,是檢驗(yàn)分子水平上遺傳變異的好手段[26-27]。

ISSR標(biāo)記雖然結(jié)合了RAPD和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),具有較高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,但在PCR反應(yīng)中受反應(yīng)條件、擴(kuò)增程序、供試材料不同的影響,其擴(kuò)增結(jié)果差異也很大。如體系中各個(gè)因素間都會(huì)發(fā)生相互作用,從而影響試驗(yàn)結(jié)果。因此,在試驗(yàn)過(guò)程中必須采用穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系。本研究證明采用不同的體系組合對(duì)紅豆草ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。通過(guò)對(duì)前人[28-30]所做的一些植物資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究的總結(jié),在 Taq DNA聚合酶的用量上,本研究最后結(jié)果確定的用量為1.5 U。但大多數(shù)研究者[28-31]在考慮到Taq DNA聚合酶價(jià)格的基礎(chǔ)上,在節(jié)省成本的情況下均選擇1 U的用量。本研究在細(xì)調(diào)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中本欲縮小 Taq DNA聚合酶用量到1 U,但由于擴(kuò)增條帶不理想,大多數(shù)泳道條帶較弱,有的甚至無(wú)條帶,故仍選擇1.5 U的用量。在dNTP的用量上,大多數(shù)研究結(jié)果的范圍均在0.15～0.30 mmol/L,并以0.2 mmol/L的用量居多[28,32-33],這與本研究的結(jié)果一致。在引物的用量上,各研究結(jié)果不一,但大多數(shù)體系的用量范圍在 0.2～0.5 μ mol/L[29-30,32-34]。本研究最終確定的引物濃度（0.4 μ mol/L）在此范圍之內(nèi)。在 Mg2+的用量上,大多數(shù)研究報(bào)道的用量范圍在 1.5～2.5 mmol/L[35],其中大多數(shù)體系對(duì)于Mg2+的用量最終確定為2.0 mmol/L,這與本研究結(jié)果一致。本研究最終利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅豆草ISSRPCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,在擴(kuò)增結(jié)果相差不大的情況下,盡可能選擇藥品使用量少、條帶清晰的泳道,從而確定了最佳反應(yīng)體系。

對(duì)53個(gè)引物進(jìn)行篩選,最終篩選出12個(gè)條帶清晰、多態(tài)性較好的引物。由于影響ISSR分析中的PCR擴(kuò)增的因素比較復(fù)雜,尤其是擴(kuò)增程序中的退火溫度。較低的退火溫度允許適當(dāng)錯(cuò)配,擴(kuò)大了引物在基因組中配對(duì)的隨機(jī)性,而較高的退火溫度雖可提高配對(duì)的專(zhuān)一性,卻會(huì)影響引物與模板的結(jié)合程度。因此,隨機(jī)設(shè)置12個(gè)退火溫度梯度對(duì)各個(gè)引物進(jìn)行最佳退火溫度的篩選,最終確定各引物的最佳退火溫度。

周桂元等[36]通過(guò)返回式衛(wèi)星搭載后的花生（Arachis hypogaea）種子,返回地面經(jīng)過(guò)多年的種植和選擇,在試驗(yàn)中獲得21個(gè)變異株系。用SSR技術(shù)檢測(cè)21個(gè)變異株系的基因位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了變異,并通過(guò)與形態(tài)變異的聯(lián)系,表明太空處理能夠誘導(dǎo)花生產(chǎn)生變異。類(lèi)似的結(jié)果在水稻（Oryza sativa）、菜豆（Phaseolus vulgaris）和番茄（Lycopersicon esculentum）航天育種研究上也有報(bào)道[37-40]。本研究經(jīng)過(guò)12個(gè)引物擴(kuò)增后,證明了空間環(huán)境對(duì)植物基因位點(diǎn)的影響,同時(shí)說(shuō)明航天誘變的方法確實(shí)可引起植株分子水平上的遺傳變異,而非僅僅表面上的暫時(shí)性變異。說(shuō)明航天誘變可作為今后紅豆草種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種選育的方法之一。

4 結(jié)論

1）紅豆草ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為:2.5 μ L 10×PCR buffer、50 ng 模板 DNA 、dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶 1.5 U、引物 0.4 μ mol/L 、Mg2+2.0 mmol/L,總體積為 25 μ L 。

2）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析,共獲得193個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)142個(gè),多態(tài)性比率為73.6%,每個(gè)引物的擴(kuò)增位點(diǎn)為10～23個(gè),平均16.1個(gè),其中多態(tài)性位點(diǎn)7～18個(gè),平均11.8個(gè)。

3）搭載植株的多態(tài)位點(diǎn)比率、Nei基因多樣度和Shannon多樣性指數(shù)均高于地面對(duì)照。

[1]喻志軍.我國(guó)航天育種的進(jìn)展[J].中學(xué)生物教學(xué),2003（5）:33-34.

[2]李金國(guó),劉敏,王培生,等.空間條件對(duì)番茄誘變作用及遺傳的影響[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2000,13（2）:114-118.

[3]李源祥.航天育種新成果贛早秈47[J].中國(guó)種業(yè),2001（3）:42.

[4]王慧,張建國(guó),陳志強(qiáng).航天育種優(yōu)良水稻品種華航一號(hào)[J].中國(guó)稻米,2003（6）:18.

[5]密士軍,郝再彬.航天誘變育種研究的新進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2002（4）:31-33.

[6]杜連瑩,韓微波,張?jiān)聦W(xué),等.“實(shí)踐八號(hào)”搭載8個(gè)苜蓿品種細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究[J].草業(yè)科學(xué),2009,26（12）:46-49.

[7]李建彬,洪亞輝,周樹(shù)良,等.棉花種子航天搭載主要經(jīng)濟(jì)與農(nóng)藝性狀變異的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008（1）:25-26,31.

[8]劉錄祥,郭會(huì)君,趙林姝,等.我國(guó)作物航天育種 20年的基本成就與展望[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2007,21（6）:589-592.

[9]劉錄祥,趙林姝,郭會(huì)君.作物航天育種研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2007,9（2）:26-29.

[10]翟桂玉.高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豆科牧草紅豆草[EB/OL].（2007-07-04）[2010-03-15].http://lagri-jzst.cn/ReadNews.asp（NewsID=17711）.

[11]Zietkiewicz E,Rafslski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[12]Mcroberts N,Sinclair W,Mcpherson A,et al.An assessment of genetic diversity within and between populations ofPhalarisminorusing ISSR markers[J].Weed Research,2005,45（6）:431-439.

[13]肖海峻,徐柱.鵝觀草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007:5-6.

[14]Li M,Guo W L,Hu L J,et al.Genetic variationin natural populations ofHordeumbrevisubulatumnative to the SongnenPrairie in northeasternChina:Comparison of four nuclear DNA markers[J].Canadian Journal of Plant Science,2007,87（4）:773-790.

[15]Gyulai G,Dweikat I,Janovszky J,et al.Application of ISSR/SSR-PCR for genome analysis ofAgropyron,Bromus,andAgropyron×Bromus[A].In:Staszewski Z,Mlyraec W,Osinski R.Ecological aspects of breeding fodder crops and amenity grasses[C].Radzikow,Poland:PBAI,1997:306-312.

[16]徐云遠(yuǎn),王嗚剛,賈敬芬.衛(wèi)星搭載紅豆草后代中耐鹽細(xì)胞系的篩選及鑒定[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),2001,34（1）:11-15.

[17]謝甫綈,Takahata Y.利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行不同來(lái)源大豆品種的分類(lèi)[J].大豆科學(xué),2005,24（3）:161-165.

[18]王玉民,姜昱,康嶺生,等.利用ISSR技術(shù)探討大豆屬植物的親緣關(guān)系[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,32（6）:30-32,38.

[19]Jin Y,Zhang W J,Fu D X,et al.Sampling strategy within a wild soybean population based on its genetic variation detected by ISSR markers[J].Journal of Integrative Plant Biology,2003,45（8）:995-1002.

[20]謝甫綈,Takahata Y,Yasuo O.利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行菜用大豆和普通大豆的分類(lèi)[J].大豆科學(xué),2008,27（5）:732-739.

[21]劉美華,李忠超,陳海山.昆侖錦雞兒（豆科）的遺傳多樣性研究[J].廣西植物,2005,25（1）:53-57.

[22]解新明,盧小良.SSR和ISSR標(biāo)記及其在牧草遺傳與育種研究中的應(yīng)用前景[J].草業(yè)科學(xué),2005,22（2）:30-37.

[23]Yeh F C,Yang R C,Boyle T,et al.POPGENE,the user friendly shareware for population genetic analysis[M].Edmonton,Canada:Molecular Biology and Biotechnology Center,University of Alberta,1997.

[24]張麗,周蘭英,肖千文.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在建立杜鵑花RAPD-PCR反應(yīng)體系中的應(yīng)用[J].北方園藝,2007（5）:124-126.

[25]Planel H,Ganbin Y,Pianezzi B,et al.Space environment factors affecting response to radiation at the cellular level[J].Advances in Space Reserch,1989,9（10）:157-160.

[26]羅海燕,陳業(yè)淵.ISSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,14（19）:45-46,27.

[27]袁昭嵐,沈頌東,黃鶴忠,等.SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在遺傳多態(tài)性方面的應(yīng)用[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2005,26（2）:10-13.

[28]桂騰琴,喬愛(ài)民,孫敏,等.果梅ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2007,29（10）:124-128.

[29]郭凌飛,鄒明宏,曾輝,等.澳洲堅(jiān)果ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].林業(yè)科學(xué),2008,44（5）:160-164.

[30]羅玥佶,伍賢進(jìn),彭帥,等.翻白草總 DNA的提取與ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36（3）:895-897,901.

[31]林新堅(jiān),江秀紅,蔡海松,等.姬松茸ISSR特異擴(kuò)增體系的研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2007,14（4）:25-30.

[32]權(quán)俊萍,袁菊紅,穆紅梅,等.百里香屬植物 ISSRPCR和SRAP-PCR體系的確立及優(yōu)化[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2008,17（2）:1-8.

[33]林鄭和,陳榮冰,陳常頌.茶樹(shù) ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,21（3）:247-252.

[34]劉忠輝,劉國(guó)道,黃必志,等.云南豬屎豆屬遺傳多樣性的ISSR分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18（5）:184-191.

[35]張青林,羅正榮.ISSR及其在果樹(shù)上的應(yīng)用[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2004,21（1）:54-58.

[36]周桂元,洪彥彬,林坤耀,等.花生空間誘變及SSR標(biāo)記遺傳多態(tài)性分析[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2007,29（3）:238-241.

[37]周峰,易繼財(cái),張群字,等.水稻空間誘變后代的微衛(wèi)星多態(tài)性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22（4）:55-57.

[38]張 健,李金國(guó),王培生,等.菜豆空間突變品系的分子生物學(xué)分析[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2000,13（6）:410-413.

[39]鹿金穎,劉敏,薛淮,等.俄羅斯“和平”號(hào)空間站搭載的番茄隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2005,18（1）:72-74.

[40]印紅,陸偉,謝申猛.搭載后紅曲霉菌突變株的染色體DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析研究[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2004,17（5）:374-376.