鄭源海，周艷貞，林元峰，周藝華

(福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院檢驗科，福建 漳州363000)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種非細胞毒性病毒，其所致的肝細胞損壞是由機體針對HBV特異性抗原的免疫反應(yīng)所引起，HBV感染所致的不同臨床結(jié)果與機體不同的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[1]。機體免疫功能及病毒逃逸免疫的能力決定了HBV感染發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[2]。本文采用直接免疫熒光法通過流式細胞儀檢測HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B 淋巴細胞 (CD19+)及采用FQ-PCR檢測血清中HBV-DNA載量水平，來評價HBV感染后血清HBV-DNA水平與機體免疫功能變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 91例慢性乙肝病毒(HBV)感染者，男64例，女27例，年齡 17～75歲，平均年齡36.9歲，符合2000第十次全國病毒性肝炎及肝病學術(shù)會議修訂的病毒性肝炎診斷標準。正常對照組31例，其中男21例，女10例，年齡22～70歲。平均年齡35.7歲，均為我院體檢中心體檢合格的健康人。

1.2 儀器和試劑 IMMUNO-TROLTMCells標準品、CD19-PE、 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標記抗體及紅細胞裂解液 (Opti Lyse○RC)購自法國Immunotech公司，流式細胞儀為Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL型流式細胞儀，HBV核酸熒光定量PCR試劑盒為廈門安普利生物工程有限公司生產(chǎn)，PCR擴增儀為Amplly公司的GeneLight9800熒光定量核酸擴增儀。

1.3 標本收集 抽取靜脈血6ml分三管，一管用EDTA-K2抗凝，用于流式細胞術(shù)檢測；另兩管為分離膠管，分離血清后用于HBV及HBV-DNA病毒檢測。

1.4 檢測方法 采用IMMUNO-TROLTMCells標準品進行校正。各取100μl抗凝血于流式專用試管中，分 別 加 入 20μl CD19-PE、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標記抗體，室溫閉光反應(yīng)20min，加入500μl紅細胞裂解液，溶解紅細胞15min，加入500μl鞘液混勻，1000rpm/min 離心 5min，棄上清，再加入500μl鞘液，混勻后上機檢測并記錄熒光抗體染色陽性 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及 CD19+百分率。HBV-DNA定量分析采用熒光定量PCR法，嚴格按照試劑說明書步驟進行，HBV-DNA檢測單位IU/ml表示。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用t檢驗，應(yīng)用SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果，P＜0.05為明顯差異，P＜0.01為顯著差異。

2 結(jié)果 見表1。

3 討論

CD3分子構(gòu)成TCR/CD3復合體為T細胞的特異性表面分子。根據(jù)T細胞表面表達CD4+CD8+分子，又分為T輔助/誘導細胞亞群(CD3+CD4+)和T抑制細胞亞群(CD3+CD8+)。TH細胞可產(chǎn)生多種淋巴因子，在體液免疫和細胞免疫的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，在病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮中心作用；同時，對病毒清除起重要作用[3]。CD8+T細胞激活和抑制嚴格依賴CD4+TH細胞，正常情況下，兩者保持一定的比例，維持機體的細胞免疫功能。TCR/CD3復合體是CD3+T細胞與T細胞抗原受體的獨特結(jié)構(gòu)(TI)結(jié)合形成的，傳遞信息。所以T淋巴細胞狀態(tài)直接反映細胞免疫狀況。本文結(jié)果表明DNA低拷貝組、高拷貝組的CD3+T細胞百分率及CD3+CD4+T與對照組、DNA陰性組比較明顯減低，表明感染者特異性T細胞作用有所加強，而T輔助/誘導細胞亞群(CD3+CD4+)細胞生成減少，使特異性抗體產(chǎn)生不足，不能清除游離的乙肝病毒,可造成病毒在體內(nèi)持續(xù)存在。CD4+/CD8+比值可監(jiān)測人體細胞免疫功能，反映機體免疫狀態(tài)的重要指標，比值失衡可能造成免疫紊亂和一系列免疫病理改變。本實驗結(jié)果表明，與正常對照組、DNA陰性組比較，低拷貝組、高拷貝組CD4+/CD8+比值顯著差異 (P＜0.01)，與相關(guān)報道一致[4-5]。 動態(tài)觀察該比值的變化趨勢可以反映HBV-DNA體內(nèi)復制情況。

表1 HBV感染者外周血T、B淋巴細胞與HBV-DNA載量水平分析

人體體液免疫是機體免疫應(yīng)答的重要組成成分之一，在人體特異免疫功能中起著重要的作用，是致敏B淋巴細胞受抗原刺激后，即轉(zhuǎn)化為漿細胞并產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體[6]。B淋巴細胞作為人體的主要體液免疫細胞，其細胞表面標志已被人們所認識，CD19+細胞代表B淋巴細胞水平。乙型肝炎病毒并不直接引起肝細胞的損傷，而是由于感染乙型肝炎病毒后引起人體細胞免疫和體液免疫應(yīng)答造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝病毒(HBV)感染者的各組CD19+明顯高于正常對照組(P＜0.05)。說明體液免疫在慢性肝炎的病程中起到關(guān)鍵作用，B淋巴細胞產(chǎn)生的抗體能對血液中的乙型肝炎病毒進行反應(yīng)加以殺滅。

綜上所述，通過對HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群及B淋巴細胞檢測，可及時提示HBV感染者免疫功能的變化并加強臨床監(jiān)測。

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