王朋

(浙江省麗水市人民醫(yī)院檢驗科，浙江 麗水 323000)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種原因不明的以中軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的全身性疾病，多侵犯骶髂關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、椎間關(guān)節(jié)和肋椎關(guān)節(jié)，本病好發(fā)于青壯年男性，預(yù)后差，致殘率高[1]，目前尚無特效的治療方法。CD4+CD25brigt調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)是近十年發(fā)現(xiàn)的T細胞亞群，具有抑制效應(yīng)T細胞功能的作用。有研究資料表明，其與AS的發(fā)生機制可能有一定的相關(guān)性。本研究旨對HLA-B27陽性患者的外周血中CD4+CD25brightTreg細胞的表達情況進行觀察分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 我院門診和住院AS疑似患者416例，其中男205例，女211例，年齡6～87歲，平均年齡(43.72±15.23)歲。對照組20例，為HLA-B27陰性者，其中男16例，女4例，年齡22～61歲，平均年齡(37.50±9.74)歲，均無異常病史，常規(guī)血生化和血免疫學(xué)檢測指標以及X線片均正常。

1.2 主要儀器和試劑 美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀。HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒；抗 CD4-FITC、抗 CD45-PreCP、抗 CD25-PE 及同型對照 IgG1-PE、CaliBRITE beads、FACS 溶血素等均購自美國BD公司。溶血素使用前先用蒸餾水1:10稀釋配成工作液。

1.3 實驗方法

1.3 .1流式細胞儀檢測HLA-B27首先對416例AS疑似患者進行HLA-B27檢測，具體操作如下：取EDTA抗凝的新鮮全血標本50μl于試管中，加10μl HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑，混勻，室溫避光孵育15min，加入1m l溶血素工作液，室溫避光溶血10min，1500r/min×5min 離心后棄上清液，加 PBS 緩沖液2ml，洗滌1次，同速度離心5min，棄上清液，加PBS緩沖液250μl混勻，Worklist自動檢測和分析軟件上機測定HLA-B27。

1.3 .2 CD4+CD25brightTreg細胞檢測 對上述3.1步驟檢測的結(jié)果進行統(tǒng)計，在HLA-B27陽性的標本中再隨機抽取其中的25例做為本文的研究對象，進行如下操作：分A和B兩管，首先每管各加EDTA抗凝血標本50μl，然后在A管加抗CD25-PE、抗CD4-FITC、 抗 CD45-PreC；B 管 加 IgG1-PE、抗CD4-FITC、抗 CD45-PreC 各 10μl，混勻，置 4℃冰箱孵育15min后用3.1中同樣的方法溶血并洗滌標本1次，加250μl的PBS緩沖液重懸細胞待上機。數(shù)據(jù)獲取與分析前使用CaliBRITE三色標準微球和FACSComp軟件調(diào)節(jié)和優(yōu)化獲取條件，然后使用CELLQuest軟件畫圖對標本進行上機檢測，最后通過CD45/SSC散點圖對淋巴細胞設(shè)門，并在CD4/CD25散點圖上進行結(jié)果分析得出數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對416例疑似AS患者進行HLA-B27檢測，結(jié)果有50例成陽性，陽性率12.02%，在這50例陽性患者中，男36例，女14例，男女陽性比例為2.57:1，男性相對多發(fā)。

2.2在隨機抽取的25例HLA-B27陽性標本中，CD4+CD25brightTreg細胞的均值較對照組偏高，統(tǒng)計結(jié)果 t=-3.262，P=0.002(P＜0.05)，二者差別具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。見表1和圖1。

表1 HLA-B27陽性者與健康對照組Treg細胞結(jié)果比較(±s)

表1 HLA-B27陽性者與健康對照組Treg細胞結(jié)果比較(±s)

注：*與對照組比較P=0.002(P＜0.05)

組別 例數(shù)(n) CD4+CD25brightTreg(%)對照組B27陽性組*20 25 2.59±0.76 3.91±1.67

圖1 CD4+CD25bright細胞含量分布

3 討論

AS在我國發(fā)病率約為0.3%[2]，筆者通過對本院門診和住院患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)HLA-B27在疑似AS患者中的陽性率則占12.02%，年齡最小者15歲，最大者87歲，男女比例為2.57:1，男性相對多發(fā)。這其中最后被確診為AS的患者HLA-B27陽性率達到97.5%，這與孫翠華等人報道的陽性率高于96%[3]，以及夏果等人報道的男女比例2.73:1[4]比較符合。AS的免疫假說認為人類的CD4+T細胞受到抗原刺激后可以向Th1、Th2和Th0三個不同水平的細胞亞群分化，雖然目前已知各亞群細胞受激后可以通過分泌各自相應(yīng)的細胞因子如：IL-2、IL-10、TNF等進入體液免疫渠道來對AS患者的自身免疫性炎癥反映進行調(diào)控，但各個亞群細胞具體在AS發(fā)病中的作用機制目前仍不十分清楚[5]，因此研究和探明它們之間的關(guān)系在時下仍十分重要。

筆者通過特異性的檢測HLA-B27陽性患者外周血CD4+CD25brightTreg細胞的含量，把它和HLAB27陰性者相對比，發(fā)現(xiàn)AS患者外周血中的Treg細胞與對照組二者之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，且AS患者中CD4+CD25brightTreg細胞含量較對照組偏高，認為AS患者免疫系統(tǒng)可能較正常人活躍[6]，本結(jié)果與Crispin等關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等其它自身免疫性疾病外周血Treg細胞表達水平下降的結(jié)論恰好相反[7]。在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，CD4+T細胞受到抗原刺激后可以產(chǎn)生相關(guān)的細胞因子，這些因子通過免疫系統(tǒng)與機體自身抗原物質(zhì)之間作用從而導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng)，這可能是引起和加重AS患者骶髂、椎間和髖等關(guān)節(jié)進行性炎癥變化的重要因素，而同時在AS患者的機體中，高水平的Treg細胞又恰好可以通過它的免疫抑制和免疫耐受這兩個主要功能產(chǎn)生對機體炎癥進展的抑制作用，這兩個對立因素共同作用的結(jié)果便是導(dǎo)致AS患者疾病進展相對緩慢?；谶@一點，筆者以為Treg細胞水平的適當提高對AS患者的治療應(yīng)該是有積極意義的，并且在治療過程中對Treg細胞的含量進行定期檢測可能會對AS患者的治療起到監(jiān)測作用。然而，就目前而言，究竟將Treg細胞提高到一個什么水平才能達到臨床想要的結(jié)果可能還需進一步探討。

另外，根據(jù)對本研究結(jié)果的觀察發(fā)現(xiàn)：AS患者不同的個體測定出來的HLA-B27結(jié)果的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)也不同，那么，在MFI不同的AS患者中CD4+CD25brightTreg細胞的變化情況又如何？這種變化與疾病之間又會有什么樣的聯(lián)系？也許同樣值得研究。

[1] George J, Daniel J.Hiparthroplasty for salvage of failed treatmentofintertrochanteric hip fractures[J].Bone Joint Surg(Am),2003,85-A(5):899-904.

[2]曾慶馀.重視強直性脊柱炎的臨床研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2002,18(1):111-112.

[3]孫翠華,孟凡杰,王玉芳,等.強直性脊柱炎與HLA-B27相關(guān)性的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(4):281-283

[4]夏 果,潘發(fā)明,張 立,等.112例強直性脊柱炎住院患者臨床特征分析[J].中華疾病控制雜志,2009,(06).

[5]隋 聰,卜海富.強直性脊柱炎發(fā)病機制與治療的研究進展[J].臨床骨科雜志,2010,13(2):217-220.

[6]黃 河,汪亞東,孫燕燕,等.強直性脊柱炎患者外周血中調(diào)節(jié)性T細胞水平研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2009,(10)

[7]Crispin JC，Martinez A，Alocer-Varela J.Quantification of regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].JAutoimmune， 2003，21(3)：273～276.