左 芳 ，程 暉 ，饒錦秀，翟中良，汪宏良

(1、湖北省黃石市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，湖北 黃石 435000；2、黃石理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系 435000)

流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的對單細胞定量分析的一種新技術(shù)，通過對流動液體中排成單列的細胞或顆粒進行逐個分析、測定細胞或顆粒的光散射和熒光情況，獲取其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA等理化特性。它借鑒了熒光技術(shù)、激光技術(shù)，單抗技術(shù)及計算機技術(shù)等多門學(xué)科和技術(shù)，有檢驗速度快、測量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大、對所需的細胞或顆粒可以進行分選等特點，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐等各個方面[1]。批量標(biāo)本檢測時，隨放置時間的延長，標(biāo)本的熒光強度會發(fā)生一定的變化，我們對HLA-B27檢測中熒光衰減與實驗結(jié)果間的關(guān)系作了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 按照1984年紐約修訂的AS(Ankylosing spondylits，AS)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，選擇 2008 年6月～2010年6月本院門診及住院AS患者56例，其中男性41例，女性15例，年齡18～41歲，平均年齡29.6歲。

1.2 實驗儀器及試劑 EPICS-XL流式細胞儀由美國貝曼庫爾特公司生產(chǎn)，標(biāo)記物(HLA-B27-FITC/HLA-R7-PE)、陰性對照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)、溶血劑 (Optilyse)、鞘液(Cell Sheath)、清洗液均由美國貝克曼公司提供。

1.3 實驗方法 患者早晨空腹采取靜脈血，EDTA-K2抗凝，混勻后待檢?？鼓?00μl加入HLAB27-FITC/HLA-B7-PE 10μl后混勻，室溫避光放置15min后加溶血劑500μl，室溫避光放置20min。加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清液，混勻后再加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清，混勻加鞘液500μl，上機測定，每份樣本檢測均設(shè)陰性對照及熒光補償。將56份陽性標(biāo)本經(jīng)過預(yù)處理后，立即上機檢測，獲取MFI值。此后，避光放置，分別 在 30min、1h、2h、4h、6h、8h 進 行 重 新 檢 測 獲 取MFI值。

1.4 檢測與結(jié)果判斷 計數(shù)HLA-B27陽性/HLAB27陰性細胞，同時記錄其MFI值。若該群占總淋巴細胞百分比大于90%時，且其平均熒光強度大于8判為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，各組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

56 例陽性標(biāo)本中，標(biāo)本放置 30min、1h、2h、4h、6h、8h后檢測后獲取的MFI值，結(jié)果見表1。

3 討論

表1 標(biāo)本在放置不同時間后檢測的結(jié)果比較(x±s)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱的慢性炎癥性疾病，早期診斷、早期治療具有重要的意義，而HLA-B27與AS的相關(guān)性則是迄今為止已知的HLA與疾病的關(guān)聯(lián)中最強和最典型的[3]。有研究發(fā)現(xiàn)超過90%的AS患者其HLA-B27表達陽性，而AS由于其癥狀與許多其他疾病相似而難以確診，因此HLA-B27的檢測結(jié)果對該病的診斷有重要意義。

流式細胞儀檢測HLA-B27主要是根據(jù)直接熒光染色及抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使鼠抗人的B27單克隆抗體與人淋巴細胞表面B27抗原結(jié)合。而HLA-B27屬交叉反應(yīng)群成員，是由分擔(dān)共同表位的HLA抗原組成的。雖然鼠源的抗HLA-B27的特異性，仍然存在不同程度的交叉反應(yīng)，而且主要是與HLA-B7的交叉反應(yīng)，造成假陽性[4]。本實驗中我們采用了雙標(biāo)記的熒光抗體，因此排除了HLAB7的交叉反應(yīng)，從而減少了假陽性和假陰性的發(fā)生。

樣品細胞的分離與固定、抗體標(biāo)記、上機測試及數(shù)據(jù)分析是流式檢驗的一個連貫過程。因此，檢測過程中的準(zhǔn)確性與可靠性將直接影響檢驗結(jié)果，如：樣本放置時間、樣本的準(zhǔn)備、固定的選擇、實驗對照的設(shè)立、免疫熒光標(biāo)記的溫度和時間及設(shè)門法對分析結(jié)果的影響等等。在實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)MFI值隨著樣本暴露時間而存在著衰減問題，特別是對于大樣本實驗室，熒光隨時間的衰減會造成對于陰陽性結(jié)果的判斷誤差。因此，應(yīng)盡量將誤差減少到最低，以得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。每次實驗必須進行光路、流路的校正及熒光補償，使儀器達到最佳狀態(tài)，每份標(biāo)本都需做陰性對照，以提高結(jié)果的可靠性。

本研究顯示，樣本立即檢測和 30min、1h、2h、4h后檢測的MFI值檢測之間無明顯差異，而樣本放置6h、8h后檢測的MFT值與樣本制備后立即檢測的MFI值之間有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與文獻[5]的報道結(jié)果基本一致。因此，制備好的樣本最好在4h內(nèi)檢測，以提高準(zhǔn)確性。

[1]郝彩霞,劉延香.流式細胞術(shù)在特發(fā)性血小板減少性紫癱臨床研究中的應(yīng)用[S].安微醫(yī)學(xué),2009(30)2:208-209.

[2] Van Der Linden SJ, Valkenburg HA, Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis: aproposal for modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361-368.

[3]李 維.強直性脊柱炎與HLA-B27[J].國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2002,23(5):295.

[4]張 琰,溫 浩,張朝霞,等.淋巴細胞HLA-B27抗原的表達及意義[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005,28(7):622-623.

[5]曹魯寧,張珍珍,仲人前,等.流式細胞儀檢測人白細胞抗原-B27的影響因素[J].檢驗醫(yī)學(xué),2007,22(3):233-234.