回 晶，李其久，邊媛媛，尤 田，龐 沖，吳 娜，胡風(fēng)慶

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

桑黃總黃酮超聲提取工藝及其生物活性研究

回 晶1，李其久1，邊媛媛1，尤 田2，龐 沖1，吳 娜1，胡風(fēng)慶1

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

目的：優(yōu)化提取桑黃總黃酮的最佳工藝條件，測(cè)定其體外抗氧化活性和對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。方法：以樣品中總黃酮的提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)桑黃的超聲輔助提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；通過(guò)測(cè)定桑黃黃酮對(duì)·OH、O2·的清除能力等指標(biāo)，探討其抗氧化活性；采用MTT法測(cè)定桑黃黃酮對(duì)大腸癌細(xì)胞CX-1增殖反應(yīng)的影響，研究其體外抗腫瘤活性。結(jié)果：桑黃總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1:20(g/ mL)、提取溫度70℃、超聲提取時(shí)間1.5h。桑黃黃酮可以有效清除·OH、O2·，對(duì)Fe2+誘發(fā)卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化反應(yīng)具有抑制作用。桑黃黃酮提取物能夠有效地抑制大腸癌細(xì)胞CX-1的生長(zhǎng)。結(jié)論：該工藝提取桑黃總黃酮，方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)短。桑黃黃酮抗氧化能力強(qiáng)，有抑制癌細(xì)胞的作用，是一種有效的天然抗氧化劑。

桑黃；總黃酮；正交試驗(yàn)；抗氧化；生長(zhǎng)抑制

桑黃(Phellinus igniarius)是擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的藥用真菌[1]?，F(xiàn)代研究表明桑黃具有抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力、抗發(fā)炎、抗氧化、預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎、保護(hù)肝臟、抗糖尿病、抗胃潰瘍等多種藥理活性[2-5]。其特有的抗腫瘤活性及低毒性使其成為研究熱點(diǎn)[6-7]，因此該菌是一種極具研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值的食藥用真菌。本研究對(duì)桑黃黃酮的提取工藝及生物活性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用桑黃提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實(shí)體購(gòu)于東北食藥用真菌研究所，由本院微生物系郭叔凡副教授鑒定，粉碎過(guò)篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%，批號(hào)TCM027-080118) 南京替斯艾么中藥研究所；大腸癌細(xì)胞系CX-1 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)；DMEM高糖培養(yǎng)基 HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) BBI公司；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BB15 CO2培養(yǎng)箱 Heraeus公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermo Labsystems公司；分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[8]

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置50mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.4mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液備用。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，置于試管中。加70%乙醇至5mL，再加入5mL顯色液(硼酸0.4g、乙酸鈉0.5g、用70%乙醇稀釋至50mL)，混勻，加相應(yīng)試劑做空白，處理后置比色杯中，在波長(zhǎng)385nm處測(cè)定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=19.796x＋0.0153，R2=0.9967。

1.3.2 超聲提取總黃酮工藝優(yōu)化

根據(jù)黃酮提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，選擇影響桑黃總黃酮提取的4個(gè)因素，即料液比、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，超聲頻率固定為90Hz，以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)超聲提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化(表1)。

表1 超聲提取總黃酮正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing the extraction processing of total flavonoids from Phellinus igniarius

1.3.3 總黃酮的鑒別

鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取桑黃總黃酮提取液1mL于試管中，加入少量鎂粉振搖，再滴入幾滴濃鹽酸，1min后溶液均顯紫紅色。

三氯化鋁顯色反應(yīng)：取桑黃總黃酮提取液適量和1%三氯化鋁乙醇溶液通過(guò)紙斑反應(yīng)后，置于紫外燈下，均顯鮮黃色熒光。

1.3.4 桑黃總黃酮含量的測(cè)定及提取率

取正交試驗(yàn)各桑黃提取液，抽濾，定容到100mL。精密吸取上述溶液0.2mL，按照1.3.1節(jié)方法測(cè)其吸光度，按照回歸方程計(jì)算提取液中的總黃酮含量。

1.3.5 桑黃總黃酮的體外抗氧化活性研究

按正交試驗(yàn)最優(yōu)提取工藝提取桑黃總黃酮，進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.1 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定[12]

利用H2O2對(duì)Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長(zhǎng)510nm處有最大吸收。反應(yīng)體系中含有2mL 9mmol/L FeSO4、2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇、不同濃度的桑黃黃酮溶液2mL，最后加2mL 8.8mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)量各濃度的吸光度?？紤]到本身的吸光度，以2mL 9mmol/L FeSO4、2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇、不同濃度的桑黃黃酮溶液2mL為黃酮的本底吸收。

式中：A0為對(duì)照(以蒸餾水代替黃酮樣品)的吸光度；Ai為加不同濃度黃酮樣品時(shí)的吸光度；A0i為無(wú)H2O2時(shí)黃酮樣品的吸光度。

1.3.5.2 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定[12]

采用鄰苯三酚自氧化法，取4.5mL pH8.2 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，混勻后在25℃水浴中保溫20min，先加入不同濃度的黃酮溶液，用蒸餾水補(bǔ)足到8.7mL，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過(guò)的0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚(以10mmol/L HCl配制，空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液)，迅速搖勻后倒入比色杯，325nm波長(zhǎng)處每隔30s測(cè)定吸光度，計(jì)算線形范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。然后按下述方法計(jì)算清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率差；ΔA為加入黃酮溶液后鄰苯三酚自氧化法速率差。

1.3.5.3 對(duì)Fe2+誘發(fā)卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用[13]

取7支具塞刻度試管，分別加入0.2mL 1:25稀釋的卵黃懸濁液(卵黃用等體積pH7.4的磷酸緩沖液配成，用前進(jìn)行磁力攪拌10min)，再分別加入1mL不同濃度的桑黃黃酮樣液、0.2mL 25mmol/L FeSO4·7H2O溶液，用磷酸緩沖液補(bǔ)足2mL，置37℃恒溫水浴中振蕩30min，取出后加入0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸溶液和1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%硫代巴比妥酸(TBA)，混勻，置100℃水浴保溫20min，冷卻后于3500r/min離心15min，取3mL上清液測(cè)定532nm處的吸光度。用VC標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照。

式中：A0為對(duì)照品(以蒸餾水代替黃酮樣品)的吸光度；A為加不同濃度黃酮樣品時(shí)的吸光度。

1.3.6 桑黃總黃酮對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

將CX-1腫瘤細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入100μL質(zhì)量濃度10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL桑黃黃酮溶液，以5μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)量濃度5μg/ mLBSA作為陰性對(duì)照，空白對(duì)照組用培養(yǎng)基代替受試藥物，每組設(shè)6個(gè)平行孔，于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄上清液，每孔加入50μL 5mg/mLMTT溶液，于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)后離心96孔板，去上清液，每孔加150μL DMSO溶解10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀振蕩，于波長(zhǎng)570nm測(cè)定OD值。并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃總黃酮提取工藝優(yōu)化

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for optimizing the extraction processing of total flavonoids from Phellinus igniarius

由表2極差值可以看出，各因素對(duì)桑黃總黃酮的提取影響程度為D＞B＞A＞C，即乙醇提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)是影響桑黃總黃酮提取的主要因素，其次是溫度，再次是料液比，對(duì)黃酮提取含量影響最小的是提取時(shí)間。

結(jié)果表明，桑黃總黃酮提取的最佳條件組合為A3B3C3D1，即料液比1:20(g/mL)、提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)的提取工藝為A3B3C3D1，并未在正交試驗(yàn)中進(jìn)行，需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。按1.3.4節(jié)方法測(cè)得總黃酮提取率為1.614%，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)論一致。

2.3 桑黃總黃酮的體外抗氧化研究

2.3.1 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測(cè)定

表3 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測(cè)定(±s, n=3)Table 3 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinusigniarius on hydroxyl free radicals (±s, n=3)

表3 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測(cè)定(±s, n=3)Table 3 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinusigniarius on hydroxyl free radicals (±s, n=3)

樣品質(zhì)量濃度/(mg/mL) A510nm清除率/%樣品組本底組0.00(CK) 0.162±0.005-0.080.162±0.0090.056±0.00234.57 0.160.202±0.0060.112±0.00644.44 0.320.235±0.0050.155±0.00550.62 0.640.329±0.0010.260±0.00657.41 VC(0.08)0.165±0.0020.025±0.00313.58

采用水楊酸法，固定反應(yīng)時(shí)間測(cè)定桑黃黃酮樣品對(duì)·OH的清除作用。結(jié)果見(jiàn)表3，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，桑黃黃酮對(duì)羥自由基的清除能力隨黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大。在質(zhì)量濃度0.64mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到57.41%以上，清除效果較好。

2.3.2 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

表4 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 (±s, n=3)Table 4 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinus igniarius on superoxide anion free radicals (±s,n=3)

表4 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 (±s, n=3)Table 4 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinus igniarius on superoxide anion free radicals (±s,n=3)

注：*.P＜0.05，與對(duì)照組相比差異顯著。

?

從表4可以看出，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，桑黃黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加呈增大的趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度0.64mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力已達(dá)到67.3%以上。除0.08mg/ mL樣品組與對(duì)照組相比無(wú)差異外，其他組與對(duì)照組相比差異顯著。桑黃黃酮提取物具有很好的清除超氧陰離子自由基能力。

2.3.3 對(duì)Fe2+誘發(fā)卵黃低密度脂蛋白多不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用

由表5可以看出，桑黃黃酮提取物和VC對(duì)Fe2+誘發(fā)卵黃低密度脂蛋白多不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化具有明顯的抑制作用，抑制作用隨樣品質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。其中桑黃黃酮提取物0.04、0.08mg/mL組與空白組相比差異顯著，0.016、0.32、0.64mg/mL組與空白組相比差異極顯著。但同濃度條件下桑黃黃酮提取物實(shí)驗(yàn)組與VC相比無(wú)顯著性差異。

表5 桑黃總黃酮提取物對(duì)PUFA過(guò)氧化反應(yīng)的抑制結(jié)果(±s, n=3)Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on peroxidation reaction of PUFA in yolk induced by Fe2+±s, n=3)

表5 桑黃總黃酮提取物對(duì)PUFA過(guò)氧化反應(yīng)的抑制結(jié)果(±s, n=3)Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on peroxidation reaction of PUFA in yolk induced by Fe2+±s, n=3)

注：*.P＜0.05，與對(duì)照組相比差異顯著；**.P＜0.01，與對(duì)照組相比差異極顯著。

?

2.4 桑黃總黃酮對(duì)大腸癌細(xì)胞CX-1的增殖抑制作用

表6 桑黃總黃酮對(duì)大腸癌CX-1的增殖抑制作用(±s, n=4)Table 6 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells (±s, n=4)

表6 桑黃總黃酮對(duì)大腸癌CX-1的增殖抑制作用(±s, n=4)Table 6 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells (±s, n=4)

注：*.P＜0.05，與對(duì)照組相比差異顯著。

?

由表6可知，空白對(duì)照組細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好，5種質(zhì)量濃度的桑黃黃酮溶液對(duì)大腸癌細(xì)胞都表現(xiàn)出抑制作用，隨著桑黃黃酮提取物質(zhì)量濃度的升高，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力越強(qiáng)，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯。通過(guò)方差分析可知，樣品1、樣品2與空白對(duì)照組相比，差異顯著；DMSO、BSA與空白對(duì)照組相比，無(wú)差異；樣品3與樣品4相比較，無(wú)差異。

3 結(jié) 論

超聲波輔助提取桑黃黃酮方法簡(jiǎn)單，時(shí)間短，最佳提取工藝條件：料液比1:20(g/mL)，提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%。

桑黃黃酮對(duì)堿性鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基和Fe2+誘發(fā)卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化產(chǎn)生的烷氧基(LO·)和烷過(guò)氧基(LOO·)均有明顯的抑制作用，且均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其清除自由基的原理是該化合物具有酚羥基，能與自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。共振半醌式自由基的穩(wěn)定性越大，黃酮類化合物的抗氧化活性越強(qiáng)。桑黃總黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化的機(jī)理可能與Gulcin等[14]的報(bào)道相一致。其抗脂質(zhì)過(guò)氧化機(jī)理主要分為兩部分，其一是通過(guò)供氫與氧化過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基(ROS)結(jié)合，終止脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到抑制氧化的作用。其二是與Fe2+螯合。金屬離子Fe2+、Cu2+等是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要促進(jìn)劑，其主要作用是促進(jìn)過(guò)氧化脂(ROOH)和脂分子(RH)的分解和氧分子活化產(chǎn)生自由基，從而可以進(jìn)入脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生。

桑黃黃酮提取物對(duì)人大腸癌細(xì)胞CX-1有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且呈一定量效關(guān)系。

通過(guò)生物體外實(shí)驗(yàn)表明，桑黃總黃酮具有體外抗氧化活性及癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，為其在生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為其作為抗氧化藥物、保健品提供了參考。下一步的研究工作將對(duì)提取物中的黃酮作進(jìn)一步的分離、純化和鑒定，探討各黃酮組分在抗氧化活性和對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中所起的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步揭示桑黃黃酮提取物抗氧化活性和抗癌機(jī)理提供理論依據(jù)。

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Ultrasound-assisted Extraction and Biological Activity of Total Flavonoids from Phellinus igniarius

HUI Jing1，LI Qi-jiu1，BIAN Yuan-yuan1，YOU Tian2，PANG Chong1，WU Na1，HU Feng-qing1
(1. Faculty of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. Liaoning Province Academic of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110034, China)

Objective: To optimize the extraction conditions of total flavonoids from Phellinus igniarius and determine its antioxidant activity and inhibition effect on the growth cancer cells. Methods: The ultrasound-assisted extraction processing parameters for total flavonoids from Phellinus igniarius were optimized by orthogonal experiments through evaluating the extraction rate of total flavonoids. The antioxidant activity of total flavonoids was explored by evaluating the scavenging capability on hydroxyl and superoxide anion free radicals. The anti-tumor activity of total flavonoids was evaluated by MTT assays through determining the inhibition effect on the proliferation of human colorectal cancer CX-1 cells in vitro. Results: The optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 55%, extraction temperature of 70 ℃, material-liquid ratio of 1:20 (g/mL) and extraction time of 1.5 h. The total flavonoids from Phellinus igniarius exhibited strong scavenging capability on hydroxyl and superoxide anion free radicals. Meanwhile, the total flavonoids could effectively inhibit the peroxidation of polyunsaturated fatty acids. Moreover, the total flavonoids had strong inhibitory effect on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells. Conclusion: This extraction processing for total flavonoids is sample and convenient. The total flavonoids from Phellinus igniarius have strong antioxidant activity and strong inhibitory effect on the growth of cancer cells. Therefore, The total flavonoids from Phellinus igniarius have a promising potential as the effective natural antioxidant and anticancer components.

Phellinus igniarius；total flavonoids；orthogonal experiment；antioxidation；growth inhibition

O623.54

A

1002-6630(2010)24-0195-04

2010-09-26

遼寧省教育廳科學(xué)基金項(xiàng)目(L2010150)；沈陽(yáng)發(fā)改委高技術(shù)研發(fā)基金項(xiàng)目(2010-16)；遼寧大學(xué)青年科研基金項(xiàng)目(2008LDQN25)

回晶(1977—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：huijing@lnu.edu.cn