丁 靖，惠伯棣*，劉 源

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

番茄果實(shí)中全反式番茄紅素的C30-HPLC外標(biāo)法定量檢測(cè)

丁 靖，惠伯棣*，劉 源

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

為建立一種在C30-HPLC上使用外標(biāo)法對(duì)番茄紅素全反式異構(gòu)體進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，采用色譜條件：固定相：YMC Carotenoid columu C30色譜柱(4.6mm×250mm，SOD-5μm，Waters)；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇(3:1，V/V)；流動(dòng)相B：甲基叔丁基醚(MTBE)；流動(dòng)相A與B中分別添加0.05%(V/V)的三乙胺；線(xiàn)性梯度洗脫：B在20min內(nèi)由0增至80%，20～35min內(nèi)B維持在80%；流速：1mL/min；色譜圖檢測(cè)波長(zhǎng)470nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫。結(jié)果表明：此方法的最小定量限為0.10μg/mL，在10～100μg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與組分峰面積的線(xiàn)性回歸方程為y=212181x，R2=0.9738。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.04%。外標(biāo)加樣回收率為97.34%(RSD為0.904%)。應(yīng)用本方法可對(duì)番茄果實(shí)中的全反式番茄紅素進(jìn)行定量分析。

全反式番茄紅素；定量分析；外標(biāo)；C30-HPLC

番茄紅素(lycopene)是一種自然界中廣泛存在的類(lèi)胡蘿卜素(carotenoid)，含有11個(gè)共軛及2個(gè)非共軛碳-碳雙鍵，主要存在于番茄、番石榴、西瓜等食物以及一些微生物中，已被證明有多種健康功能[1-2]。由于番茄紅素分子高度的不飽和結(jié)構(gòu)，使其在天然的生物合成系統(tǒng)中存在多種幾何異構(gòu)體，主要包括全反式異構(gòu)體(All E-isomer)和5-、9-和13-等順式異構(gòu)體(Z-isomer)。同時(shí)，番茄紅素在哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝時(shí)也存在多種幾何異構(gòu)體[3]。不同的異構(gòu)體具有不同的生物學(xué)功能。因此，無(wú)論在合成代謝、降解代謝和在食品中的應(yīng)用研究中，番茄紅素幾何異構(gòu)體的定性、定量檢測(cè)是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。

自從C30固定相問(wèn)世以來(lái)，番茄紅素幾何異構(gòu)體在HPLC上的分離問(wèn)題已經(jīng)解決。尤其是Sander等建立了乙腈-甲醇和甲基叔丁基醚(MTBE)的洗脫條件后，番茄紅素幾何異構(gòu)體在C30柱上具有了良好的分離和穩(wěn)定的色

譜行為[4-8]。目前，除全反式異構(gòu)體外，只有5Z-番茄紅素的定性已有報(bào)道[9]。換言之，目前番茄紅素的全反式異構(gòu)體在C30柱上具備定量的可行性[10-11]。本項(xiàng)研究旨在發(fā)展一套應(yīng)用外標(biāo)法在C30-HPLC上對(duì)番茄紅素全反式異構(gòu)體進(jìn)行定量測(cè)定的方法，并嘗試將該方法應(yīng)用于番茄果實(shí)為原料的番茄紅素源食品。這對(duì)番茄紅素的生物合成和體內(nèi)代謝等研究具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 全反式番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of all-trans-lycopene

1 材料與方法

1.1 番茄果實(shí)樣品

7、8月應(yīng)季新鮮番茄果實(shí)購(gòu)自各地超市與食品市場(chǎng)。

1.2 參比樣品

番茄紅素參比樣品(P/N：L9879)由Sigma公司提供，純度為90%～95%，使用前應(yīng)用C30-HPLC檢測(cè)其番茄紅素的幾何異構(gòu)體組成。根據(jù)不同組分的峰面積比例，計(jì)算全反式異構(gòu)體的比例大于99%。故未經(jīng)進(jìn)一步純化而直接使用。

1.3 試劑

丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚、三乙胺(BP：6 0～9 0℃)(均為分析純)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(均為色譜純)。配制好的流動(dòng)相在使用前用0.45μm的微孔濾膜(Millpore公司)過(guò)濾。配制流動(dòng)相所用的水為經(jīng)過(guò)逆流滲透處理的超純水。

1.4 儀器與設(shè)備

HPLC由1525溶劑輸送系統(tǒng)、PDA-996二極管陣列檢測(cè)器組成(美國(guó)Waters公司)，系統(tǒng)的重復(fù)性良好。在6次以上的重復(fù)性檢測(cè)中，RSD＜5%；MultiSpec-1501型分光光度計(jì) 日本島津公司；半微量分析天平(0.00001g) Precisa公司；TP114(0.0001g)電子天平 Denver儀器公司。

1.5 參比樣品儲(chǔ)備液的配制

精確(0.00001g)稱(chēng)取番茄紅素參比樣品1mg，加入1mL二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至10mL棕色容量瓶中，用石油醚定容至10mL，配制成100mg/mL的儲(chǔ)備液，保存于－20℃冰箱中。在24h之內(nèi)使用石油醚配成質(zhì)量濃度適當(dāng)?shù)墓ぷ饕?，用于HPLC分析。

1.6 樣品制備

將200～250g同產(chǎn)地、色澤均勻的果實(shí)切成碎塊放入搗碎機(jī)中搗碎。搗碎時(shí)加入1g碳酸鈉以中和細(xì)胞破碎時(shí)釋放出的有機(jī)酸。稱(chēng)取1g果實(shí)勻漿，加少量石英砂和4倍體積的丙酮研磨，靜置，用滴管小心移出上清液，重復(fù)6～8次萃取直至上清液和殘?jiān)鶠闊o(wú)色。合并收集上清液，用丙酮定容至30mL，轉(zhuǎn)入分液漏斗后加入等體積正己烷緩慢搖動(dòng)，再加入等體積蒸餾水緩慢搖動(dòng)，靜置10min，收集上相。用等體積蒸餾水洗滌上相2次，直至上相體積不再變化。收集上相，用氮?dú)獯蹈?，并充氮?dú)獗４嬗冢?0℃冰箱中，24h內(nèi)用于HPLC分析。分析前用正己烷定容，0.45μm濾膜過(guò)濾。

1.7 樣品干質(zhì)量測(cè)定

精確(0.0001g)稱(chēng)取番茄果實(shí)勻漿于玻璃表面皿(φ= 10cm)中，在70℃真空(－0.08MPa)干燥箱中烘至質(zhì)量恒定。用減重法稱(chēng)量樣品干質(zhì)量。每個(gè)樣品做6份平行，取平均值。

1.8 色譜條件

C30固定相：YMC Carotenoid column C30色譜柱(4.6mm×250mm，SOD-5μm)；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇(3:1，V/V)；流動(dòng)相B：MTBE；流動(dòng)相A與B中分別添加0.05%(V/V)的三乙胺；線(xiàn)性梯度洗脫：B在20min內(nèi)由0增至80%，20～35min內(nèi)B維持在80%；流速：1mL/ min；色譜圖監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)470nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫[12]。

1.9 質(zhì)量濃度-峰面積線(xiàn)性關(guān)系的測(cè)定

精確量取一定體積的參比樣品儲(chǔ)備液，用稀釋的方法配制成7個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，分別為0.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00mg/mL。各取20μL進(jìn)樣，在每個(gè)色譜圖上，對(duì)番茄紅素全反式異構(gòu)體組分峰積分，得到峰面積，做質(zhì)量濃度-峰面積線(xiàn)性回歸，得到回歸曲線(xiàn)和方程，計(jì)算R2值。

1.10 檢測(cè)下限的測(cè)定

按信噪比為2測(cè)定檢測(cè)下限。

1.11 重復(fù)性分析

配制質(zhì)量濃度為50.00mg/mL的番茄紅素全反式異構(gòu)體參比樣品工作液。重復(fù)HPLC分析6次。根據(jù)已測(cè)定的質(zhì)量濃度-峰面積線(xiàn)性關(guān)系，計(jì)算質(zhì)量濃度平均值和RSD。

1.12 回收率分析

在本研究中，采用添加法進(jìn)行外標(biāo)參比樣品回收率的分析。方法是將質(zhì)量濃度為50.00mg/mL的番茄紅素全反式異構(gòu)體參比樣品工作液添加到全反式番茄紅素濃度為0.49mg/mL的新鮮番茄果實(shí)萃取物中，使添加后樣品中的全反式番茄紅素的質(zhì)量濃度是鮮果萃取物中的2倍，然后重復(fù)6次做HPLC分析。

1.13 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品的制備與檢測(cè)重復(fù)6次，取平均值，RSD＜5%。

1.14 操作注意事項(xiàng)

由于番茄紅素分子的不飽和結(jié)構(gòu)，使其具有極大的不穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)室操作中最易發(fā)生的化學(xué)變化為幾何

(E/Z)異構(gòu)化和環(huán)氧化。所以，在進(jìn)行番茄紅素制備和檢測(cè)工作時(shí)，要遵循以下注意事項(xiàng)，同時(shí)操作過(guò)程要盡可能的快速。

避氧：使用惰性氣體對(duì)于番茄紅素的保護(hù)是非常有效的。在蒸發(fā)濃縮和保存時(shí)，使用氮?dú)?純度＞99.9%)或者氬氣。

避光：番茄紅素的所有操作和處理都必須避免陽(yáng)光和紫外線(xiàn)的直射。所有的操作都應(yīng)該在散射的自然光或者柔和的人工光下進(jìn)行。番茄紅素的所有溶液都應(yīng)當(dāng)用棕色玻璃瓶盛放。

溫度控制：番茄紅素的一切操作過(guò)程都應(yīng)該控制在盡可能低的溫度下。在－20℃以下條件下避光保存。如需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶液，蒸發(fā)溫度須控制在45℃以下。

避酸：番茄紅素應(yīng)嚴(yán)格避免與酸的接觸。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比樣品的色譜行為、光譜特征和幾何異構(gòu)體組成

圖2 番茄紅素參比樣品的C30-HPLC色譜行為Fig.2 Elution profile of lycopene standard separated by C30-HPLC

圖3 組分Ⅰ的電子吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectrum of fractionⅠ

對(duì)番茄紅素參比樣品進(jìn)行C30-HPLC分離獲得的色譜圖(圖2)和組分Ⅰ的電子吸收光譜圖(圖3)。根據(jù)其色譜行為(保留時(shí)間)和光譜特征(最大吸收波長(zhǎng)和光譜精細(xì)結(jié)構(gòu))確定組分Ⅰ為番茄紅素的全反式異構(gòu)體[4-8]。圖2中組分峰面積的積分顯示，該參比樣品中全反式異構(gòu)體組分(組分Ⅰ)的峰面積比例大于99%。因此，可以作為全反式異構(gòu)體的參比樣品使用。

2.2 參比樣品質(zhì)量濃度-峰面積的線(xiàn)性關(guān)系

圖4 番茄紅素全反式異構(gòu)體組分的質(zhì)量濃度與其峰面積的線(xiàn)性回歸Fig.4 Linear correlation between the concentration of all-translycopene and corresponding peak area

在C30-HPLC上測(cè)定番茄紅素全反式異構(gòu)體組分與其峰面積的線(xiàn)性關(guān)系時(shí)，將7個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液分別進(jìn)樣20μL。在每個(gè)樣品的色譜圖上計(jì)算全反式異構(gòu)體組分的峰面積，得到線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)圖4及回歸方程：y=212181x(R2=0.9738)。線(xiàn)性區(qū)間為10～100mg/mL。

2.3 檢測(cè)下限

按信噪比為2測(cè)定檢出下限為0.01mg/mL。

2.4 重復(fù)性分析

重復(fù)測(cè)定6次的參比樣品質(zhì)量濃度的平均值為48.81mg/mL，RSD為4.04%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 重復(fù)性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table1 Results of reproducibility experiments

2.5 回收率分析

表2 回收率分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table2 Results of recovery rate experiments

本實(shí)驗(yàn)采用添加法進(jìn)行全反式番茄紅素參比樣品的回收率分析(C30系統(tǒng)分析結(jié)果見(jiàn)表2)。由表2結(jié)果與文

獻(xiàn)[13]中C18柱上的分析結(jié)果相比較可知，番茄紅素全反式異構(gòu)體在C30柱上損失略高。其原因可能為按照“草叢”原理，全反式異構(gòu)體與C30基團(tuán)的吸附能力較與C18基團(tuán)強(qiáng)[4]。

2.6 番茄果實(shí)中全反式番茄紅素的定量測(cè)定

圖5為河北滄州市7、8月產(chǎn)番茄果實(shí)萃取物的C30-HPLC色譜圖。根據(jù)其色譜行為(保留時(shí)間)和光譜特征(最大吸收波長(zhǎng)和光譜精細(xì)結(jié)構(gòu))與參比樣品的比較，組分Ⅰ被鑒定為全反式番茄紅素。根據(jù)已有的報(bào)道[4-8]，組分Ⅱ鑒定為全反式β-胡蘿卜素。圖6為新疆庫(kù)爾勒市7、8月產(chǎn)番茄果實(shí)萃取物的C30-HPLC色譜圖。根據(jù)其色譜行為和光譜特征與參比樣品的比較，組分Ⅰ鑒定為全反式番茄紅素。根據(jù)其光譜特征和已有的報(bào)道[4-8]，組分Ⅱ被鑒定為5Z-番茄紅素，組分Ⅲ被鑒定為13Z-番茄紅素。從圖5可以看到，庫(kù)爾勒地區(qū)產(chǎn)的番茄果實(shí)中有相當(dāng)數(shù)量的5-和13-順式異構(gòu)體存在。從圖5、6的比較可以看出，不同產(chǎn)地的番茄中番茄紅素幾何異構(gòu)體的比例有明顯區(qū)別。由于不同異構(gòu)體的生物學(xué)功能和效價(jià)不同[12]，不同產(chǎn)地番茄果實(shí)中番茄紅素的生物學(xué)效價(jià)(甚至功能)亦可能出現(xiàn)差別。因此，在對(duì)番茄及其制品中番茄紅素的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估時(shí)，測(cè)定其幾何異構(gòu)體組成是最理想的做法。由于全反式異構(gòu)體在數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)[2,14-15]，測(cè)定其中全反式異構(gòu)體的數(shù)量具有極其重要的意義。表3為應(yīng)用外標(biāo)法測(cè)得不同產(chǎn)地鮮食型番茄中全反式番茄紅素的含量。

圖5 河北滄州市產(chǎn)番茄果實(shí)萃取物的C30-HPLC色譜行為Fig.5 Elution profile of extract from tomato fruits in Cangzhou separated by C30-HPLC

圖6 新疆庫(kù)爾勒市產(chǎn)番茄果實(shí)萃取物的C30-HPLC色譜行為Fig.6 Elution profile of extract from tomato fruits in Kuerle separated by C30-HPLC

表3 不同番茄中全反式番茄紅素的含量測(cè)定Table3 Contents of all-trans-lycopene from different kinds of tomato fruits

3 結(jié) 論

本研究表明，運(yùn)用C30-HPLC外標(biāo)法定量檢測(cè)番茄果實(shí)中全反式番茄紅素是切實(shí)可行的，這對(duì)確定不同番茄紅素源中番茄紅素順?lè)串悩?gòu)體之間的比例，從而研究其生物學(xué)功能和效價(jià)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Quantification of All-trans-lycopene from Tomato Fruits by C30-HPLC with External Standard Method

DING Jing，HUI Bo-di*，LIU Yuan
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

An external standard method was established to determine all-trans-lycopene on C30-HPLC. Stationary phase was YMCTM Carotenoid column C30 (4.6 mm × 250 mm, SOD-5μ m, Waters); mobile phase A was acetonitrile-methanol (3:1, V/ V); mobile phase B was methyl tert-butyl ether (MTBE); both mobile phase A and B were added 0.05% (V/V) triethylamine; linear gradient elution was conducted with an increase of mobile phase B from 0 to 80% (V/V) in 20 min followed by maintaining at 80% mobile phase B for 15 min; flow rate was 1.0 mL/min; monitoring wavelength was 470 nm; injection volume was 20μ L; column temperature was set at room temperature. Under these determination parameters, the minimum detection limit was 0.10μ g/mL; in the range of 10－100μ g/mL, linear correlation equation was y = 212181x (R2= 0.9738) with a RSD of 4.04%. The recovery rate of external standard was 97.34% with a RSD of 0.904%. Therefore, this established method is suitable for determining alltrans-lycopene in tomato fruits.

all-trans-lycopene；quantification；external standard；C30-HPLC

TS201.2

A

1002-6630(2010)22-0453-04

2010-07-19

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI58B06)

丁靖(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)轭?lèi)胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)。E-mail：ading1110@126.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)轭?lèi)胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn