丁曉靜，楊媛媛，李 蕓，趙 珊，王 志

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

毛細(xì)管電泳法對(duì)乳及乳制品中真蛋白的測(cè)定

丁曉靜1,2，楊媛媛1,3，李 蕓1,2，趙 珊1，王 志3

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

利用毛細(xì)管電泳法對(duì)市售乳清蛋白粉、采自當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)的牛初乳及原料奶、同一品牌不同階段或同一階段內(nèi)不同廠家、不同國(guó)別的嬰兒配方奶粉、不同保質(zhì)期的液態(tài)奶、不同國(guó)別的超高溫滅菌(UHT)奶和酸奶、國(guó)產(chǎn)復(fù)原乳中α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白A (β-LgA)及β-乳球蛋白B (β-LgB)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：α-Lac、β-LgA及β-LgB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在乳清蛋白粉、牛初乳及原料奶中依次降低。液態(tài)奶中上述3種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與保質(zhì)期有關(guān)，一般保質(zhì)期越久的產(chǎn)品，上述3種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低。大多數(shù)酸奶中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于UHT奶。嬰兒配方奶粉中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著階段數(shù)的增加而增加，而且同一階段內(nèi)不同廠家不同國(guó)別配方奶粉中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異也較大，并非進(jìn)口奶粉中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比國(guó)產(chǎn)奶粉高。

毛細(xì)管電泳；乳清蛋白粉；牛初乳；原料奶；嬰兒配方奶粉；超高溫滅菌奶；酸奶

乳及乳制品是人體獲取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，蛋白含量的高低已成為乳品質(zhì)量的指標(biāo)之一[1]。為了生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的乳品，發(fā)達(dá)國(guó)家十分重視乳品基礎(chǔ)性研究，對(duì)乳品中蛋白檢測(cè)非常重視并在技術(shù)上具有優(yōu)勢(shì)。我國(guó)雖已開(kāi)展了相關(guān)工作，但相對(duì)薄弱且未形成系統(tǒng)，檢測(cè)技術(shù)主要是凱氏定氮法和比色法[2]，這兩種方法均是通過(guò)測(cè)定樣品中的氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，乘以系數(shù)6.38來(lái)推算出樣品中的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但此法所測(cè)的氮元素有可能包括樣品中的非蛋白氮，近幾年發(fā)生的“大頭娃娃”、“三聚氰胺”毒奶粉事件正是由于這兩種方法

的局限性為不法分子摻加含氮有機(jī)物以提高蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提供了可乘之機(jī)，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的利益，在很大程度上制約了我國(guó)乳業(yè)的良性發(fā)展。盡管新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)能夠測(cè)定乳品中非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)[3]，但仍不能直觀地反映乳品中真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此，監(jiān)測(cè)乳品中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制、提高產(chǎn)品檔次、增強(qiáng)國(guó)有產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

乳及乳制品中蛋白主要分為酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白約占總蛋白的80%，乳清蛋白約占15%。因?yàn)槿榍宓鞍资桥Ｄ痰闹饕煞种唬浜康母叩徒?jīng)常被用于評(píng)價(jià)乳品質(zhì)量[4]。乳清蛋白是酪蛋白沉淀后清液中含有的蛋白[5]，主要由對(duì)熱不穩(wěn)定的α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白(Ig)和牛血清白蛋白(BSA)組成。對(duì)熱穩(wěn)定性依下列順序Ig＜BSA＜β-Lg＜α-Lac而增加[6-7]，即α-Lac對(duì)熱較為穩(wěn)定。其中α-Lac約占乳蛋白的3%、β-Lg約占9%、Ig占2%、BSA占1%，β-Lg又由β-LgA及β-LgB組成[8]。上述蛋白構(gòu)成了乳中的“真蛋白”。目前世界上越來(lái)越多的國(guó)家如美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞等開(kāi)始采用真蛋白含量作為原料乳收購(gòu)的計(jì)價(jià)因子，然而，由于該法依據(jù)的原理仍然是凱氏定氮法，因而可能會(huì)因不法分子摻加大豆水解蛋白等植物蛋白而失靈。國(guó)外又開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)真蛋白的方法，主要有紅外光譜分析法、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線法及染料染色法等方法，但僅有一部分的乳品真蛋白快速檢測(cè)方法被AOAC認(rèn)可[1]。

毛細(xì)管電泳法(CE)因分離效率高，非常適合擴(kuò)散系數(shù)小的蛋白質(zhì)分析，已成功地用于保健食品中免疫球蛋白G的檢測(cè)[9-10]，乳及乳制品成分分析和真蛋白定量測(cè)定[11-15]。十二烷基硫酸鈉(SDS)-CE法已被作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ISO、IDF)方法用于檢測(cè)奶粉中是否摻入大豆或花生蛋白[16]。我國(guó)尚未用CE法對(duì)乳及乳制品中的α-Lac、β-LgA及β-LgB開(kāi)展系統(tǒng)研究。因此，本研究利用CE技術(shù)分離測(cè)定乳及乳制品中α-Lac、β-LgA及β-LgB 3種蛋白[17]，通過(guò)乳清蛋白中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的這3種蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的趨勢(shì)，以期探索一種能夠有效監(jiān)測(cè)、控制乳及乳制品的產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)消費(fèi)者的利益及健康的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑及電泳條件請(qǐng)?jiān)斠?jiàn)文獻(xiàn)[17]。乳清蛋白粉、嬰兒配方奶粉、液態(tài)奶樣品及酸奶樣品均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，牛初乳及原料奶均采自?dāng)?shù)啬膛?chǎng)。所有樣品均平行測(cè)定兩次。

1.2 儀器與設(shè)備

Beckman P/ACE 5000型毛細(xì)管電泳儀(配有紫外檢測(cè)器和P/ACE工作站) 美國(guó)Beckman公司；F-33 pH/mV型酸度計(jì) 北京屹源電子儀器科技公司；Universal 32型離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；Millipore Milli-Elix/RiOs型超純水器 美國(guó)Millipore公司；旋渦混合器 法國(guó)Gilson公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白粉的測(cè)定

稱取0.5g樣品置于50mL塑料離心管中，加入20mL 0.05mol/L HAc溶液(pH2.98)，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液直接進(jìn)樣分析，所測(cè)樣品通過(guò)加標(biāo)來(lái)定性，以校正峰面積法定量(表1)。因?yàn)樵贑E分析中，遷移時(shí)間較長(zhǎng)的組分，其峰面積將相應(yīng)展寬而導(dǎo)致峰面積增加，為消除這一影響，一般將每個(gè)峰的峰面積除以各自的遷移時(shí)間即校正峰面積進(jìn)行定量[18]。

表1 乳清蛋白粉中α-Lac、β-LgA、β-LgB測(cè)定結(jié)果Table1 Results ofα-Lac, β-LgA and β-LgB in whey protein powder

2.2 牛初乳、原料奶的測(cè)定

圖1 牛初乳和原料奶的毛細(xì)管電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of bovine colostrum and raw milk

牛初乳是母牛生產(chǎn)后7d內(nèi)產(chǎn)下的乳汁，具有極高

的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。原料奶亦稱生鮮奶，為初乳期過(guò)后采集的常奶。準(zhǔn)確移取2mL牛初乳或原料奶于50mL塑料離心管中，加入18mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表2，電泳圖如圖1所示。

表2 牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA和β-LgB的測(cè)定結(jié)果Table2 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in bovine colostrum and raw milk

由表2可以看出，牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，一般情況下，β-乳球蛋白(β-Lg)的兩個(gè)遺傳變異體β-LgA和β-LgB總是同時(shí)存在，但在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的1#初乳樣品中卻不含β-LgB，5#初乳樣品中不含β-LgA，這兩種極端情況與Kim等[19]報(bào)道的情況相一致，極端情況與β-LgA及β-LgB的等位基因有關(guān)。

2.3 不同保質(zhì)期牛奶樣品的測(cè)定

表3 不同保質(zhì)期牛奶樣品中α-Lac、β-LgA和β-LgB的測(cè)定結(jié)果Table3 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in milk of different shelf-life

從市場(chǎng)選取國(guó)產(chǎn)同一品牌、不同保質(zhì)期的牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確移取2mL牛奶樣品于15mL塑料離心管中，加入3mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表3，電泳圖見(jiàn)圖2。保質(zhì)期為3d和7d的產(chǎn)品為巴氏殺菌奶，3種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，蛋白被破壞程度小，而保質(zhì)期為30、50、180d和240d的產(chǎn)品均為UHT奶，3種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降，β-LgA和β-LgB已經(jīng)無(wú)法檢出，其中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別不大，保質(zhì)期為30d的牛奶的電泳圖不同于保質(zhì)期為240d的牛奶的電泳圖，從圖2中很容易辨別是巴氏殺菌奶還是超高溫滅菌奶。

圖2 不同保質(zhì)期的牛奶樣品及6#樣品加100mg/L 3種蛋白混標(biāo)電泳圖Fig.2 Electrophoregrams of milk of different shelf-life and sample 6#spiked with 100 mg/L of three mixed protein standards

2.4 不同國(guó)別、不同廠家UHT奶的測(cè)定

表4 進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)UHT奶中α-Lac的測(cè)定Table4 Content ofα-Lac in UHT milk from imported and domestic products

從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)不同國(guó)家生產(chǎn)的UHT奶，為便于比較，對(duì)每一國(guó)家生產(chǎn)的UHT奶均采集同一廠家但不

同口味的產(chǎn)品，按2.3節(jié)方法處理樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表4所示，同一廠家但不同口味的產(chǎn)品中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異；無(wú)論是進(jìn)口還是國(guó)產(chǎn)UHT奶，其中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定差異，可能與生產(chǎn)工藝或原料奶來(lái)源有關(guān)。

2.5 復(fù)原乳樣品的測(cè)定

由于當(dāng)前市場(chǎng)上標(biāo)識(shí)有復(fù)原乳的樣品較少，將采自當(dāng)?shù)爻袊?guó)內(nèi)某廠家的5個(gè)標(biāo)識(shí)為復(fù)原乳、保質(zhì)期均為15個(gè)月的樣品，按2.3節(jié)方法處理樣品進(jìn)行測(cè)定。由于復(fù)原乳至少經(jīng)過(guò)二次受熱，其中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降，僅在盒裝的復(fù)原乳中檢測(cè)到α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.6mg/100g，其余4種罐裝復(fù)原乳樣品中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于定量限，無(wú)法準(zhǔn)確定量。這兩種包裝的產(chǎn)品中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異或許與加工工藝有關(guān)。另外，復(fù)原乳中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于國(guó)產(chǎn)UHT奶，或許通過(guò)這種途徑很容易判斷所謂的鮮奶是否為復(fù)原乳。

2.6 酸奶樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2g酸奶樣品于15mL塑料離心管中，加入3mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。分別測(cè)定不同國(guó)家、不同廠家的酸奶樣品，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)酸奶樣品中不含易致敏的β-lgA及β-lgB，僅含α-Lac，這也證明對(duì)牛奶過(guò)敏的人喝酸奶則不易過(guò)敏。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同國(guó)別、不同廠家酸奶樣品中α-Lac測(cè)定Table5 Content ofα-Lac in yogurt from different countries and plants

由表5可知，酸奶樣品中的α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)比UHT牛奶樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)普遍偏高，進(jìn)口樣品中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大多高于國(guó)產(chǎn)樣品，西班牙樣品的保質(zhì)期達(dá)270d，其中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)比國(guó)產(chǎn)奶制品保質(zhì)時(shí)間只有20d左右的樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)還要高，澳大利亞的5#樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)97mg/100g，與原料奶中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，說(shuō)明在產(chǎn)品加工過(guò)程中蛋白損失少。但并非所有的酸奶樣品α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高，如國(guó)產(chǎn)中的16#樣品，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于方法的定量限，無(wú)法準(zhǔn)確定量。2.7不同階段配方奶粉中α-Lac的測(cè)定

母乳中含有豐富的α-Lac且不含β-LgA及β-LgB，Lucla等[20]采用反相高效液相色譜法測(cè)定不同人群不同哺乳期的母乳中α-Lac質(zhì)量濃度，其測(cè)定值在160～825mg/ 100mL范圍內(nèi)，因此，α-Lac經(jīng)常被添加到嬰兒配方奶粉中以提高奶粉的母乳化程度，同時(shí)除去其中嬰幼兒不耐受的β-lgA及β-lgB。此外還添加了利于嬰兒健康成長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，這些添加的組分干擾β-LgA及β-LgB的準(zhǔn)確測(cè)定，因而用文獻(xiàn)[17]方法只能測(cè)定奶粉中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。準(zhǔn)確稱取0.5g樣品于15mL塑料離心管中，加入5mL樣品溶液，渦旋混勻后于9000r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。從市場(chǎng)上采購(gòu)的1#、2#和3#三個(gè)品牌的Ⅰ段(嬰兒配方奶粉)、Ⅱ段(較大嬰兒配方奶粉)和Ⅲ段(幼兒配方奶粉)奶粉中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)值見(jiàn)表6，電泳圖見(jiàn)圖3～5。

表6 不同階段奶粉中α-Lac的測(cè)定Table6 Content ofα-Lac in infant formula of different age stages

圖3 1#樣品3個(gè)階段及Ⅲ段加標(biāo)電泳圖Fig.3 Electrophoregrams of three age stages of sample 1#and age stage III spiked with three mixed proteins

圖4 2#樣品3個(gè)階段及Ⅲ段加標(biāo)電泳圖Fig.4 Electrophoregrams of three age stages of sample 2#and age stage III spiked with three mixed proteins

圖5 3#樣品3個(gè)階段電泳圖Fig.5 Electrophoregrams of three age stages of sample 3#

表6結(jié)果表明：同一階段內(nèi)的不同樣品中α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，存在較大差異。不同階段的配方奶粉具有不同的α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而且隨著階段數(shù)的增加，α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，這種質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化應(yīng)該與嬰幼兒的成長(zhǎng)需要相關(guān)。

2.8 同一階段內(nèi)國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口奶粉的比較

表7 同一階段國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口奶粉中α-Lac測(cè)定Table7 Content ofα-Lac in infant formula from domestic and imported products with the same age stage

表7表示同一階段內(nèi)，不同國(guó)別、不同廠家的奶粉中α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過(guò)同一階段內(nèi)國(guó)產(chǎn)奶粉與進(jìn)口奶粉的比較，發(fā)現(xiàn)并不是所有進(jìn)口奶粉的α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)都比國(guó)產(chǎn)奶粉高，如進(jìn)口奶粉中的6#、13#、19#等樣品，其α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有21、43、19mg/100g，此值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他奶粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，而某些國(guó)產(chǎn)奶粉的α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)與進(jìn)口奶粉相當(dāng)，甚至高于進(jìn)口奶粉，如國(guó)產(chǎn)奶粉的3#、4#、9#、14#等樣品，其α-Lac質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為167、212、234、310mg/100g。

3 結(jié) 論

無(wú)論是牛初乳，還是原料奶，其中的α-Lac、β-LgA及β-LgB三種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于市售巴氏殺菌奶和UHT奶，證明巴氏或UHT殺菌加工過(guò)程中，能降低原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB三種蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。α-Lac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依原料奶、巴氏乳及UHT奶的順序而依次降低，與涂層毛細(xì)管的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[21]。隨著CE技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，因其較適合蛋白分析且綠色、環(huán)保，在乳及乳制品中真蛋白分析中將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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Use of Capillary Electrophoresis for Determination of Genuine Proteins in Milk and Milk Products

DING Xiao-jing1,2，YANG Yuan-yuan1,3，LI Yun1,2，ZHAO Shan1，WANG Zhi3
(1. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China；2. School of Public Health and Family Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China；3. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

The contents of theα-lactalbumin (α-Lac), β-lactoglobulin A (β-LgA) and β-lactoglobulin B (β-LgB) were determined by capillary electrophoresis in whey protein powder, bovine colostrum and raw milk from the local farm, infant formula of the same brand but for different age stages or of the same age stages from different plants and countries, liquid milk with different shelf-life, ultra-high temperature (UHT) milk and yogurt from different countries and domestic reconstituted milk. The contents of the above three proteins decreased in the order of whey protein powder, bovine colostrum and raw milk, and were negatively related to the shelf-life of milk and milk products. The content of α-Lac in most of the yogurts were higher than that in UHT milk. The contents of the α-Lac in infant formula increased with the age stage. Infant formula with the same age stages of different brands and countries had significant differences in the contents of α-Lac. The contents of α-Lac in imported formula were not always higher than those from domestic ones. The results provide a valuable asset for the analysis of true proteins in milk and milk products.

capillary electrophoresis；whey protein powder；bovine colostrum；raw milk；infant formula；ultrahigh temperature (UHT) milk；yogurt

O657.8

A

1002-6630(2010)22-0361-06

2010-03-05

北京市“十百千”衛(wèi)生人才培養(yǎng)項(xiàng)目

丁曉靜(1968—)，女，副主任技師，博士，研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生理化檢驗(yàn)。E-mail：dingxiaojing@gmail.com