包怡紅，李文星，齊君君，王振宇*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

提取條件對(duì)藍(lán)靛果花色苷抗氧化活性的影響

包怡紅，李文星，齊君君，王振宇*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

為研究提取條件對(duì)藍(lán)靛果花色苷抗氧化活性的影響，用溶劑浸提法提取藍(lán)靛果花色苷，通過正交試驗(yàn)確定其最佳提取工藝條件，分別采用紫外分光光度法、H2O2/Fe體系和DPPH法測(cè)定花色苷的提取量及其抗氧化活性。結(jié)果表明，提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液、料液比1:15(g:mL)、提取溫度60℃、提取時(shí)間90min、pH2、提取3次為最佳提取工藝參數(shù)，在此提取工藝條件下，花色苷含量吸光度為0.789，羥自由基清除率為18.92%，DPPH自由基清除率為41.57%。

藍(lán)靛果；花色苷；提取工藝條件；抗氧化

藍(lán)靛果(Lonicera edulis)別稱藍(lán)靛果忍冬，屬忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera L.)。藍(lán)靛果果實(shí)為漿果，富含糖類、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、多種維生素和微量元素，是理想的天然保健營(yíng)養(yǎng)食品，被世界糧農(nóng)組織定為世界稀有珍貴野生漿果。在我國(guó)藍(lán)靛果主要分布于北緯40°～53°之間小興安嶺和長(zhǎng)白山等地，抗晚霜能力強(qiáng)，屬耐寒植物[1-3]。

藍(lán)靛果因其潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和商用價(jià)值，具有極為廣闊的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)。前蘇聯(lián)學(xué)者從20世紀(jì)60年代起，深入研究藍(lán)靛果，并發(fā)現(xiàn)了該果中含有豐富的VP活性物質(zhì)，俄羅斯把藍(lán)靛果加工成宇航員專用的飲料。我國(guó)有關(guān)專家從20世紀(jì)80年代開始對(duì)藍(lán)靛果營(yíng)養(yǎng)保健功能進(jìn)行專項(xiàng)研究，相繼開發(fā)出的飲料、果汁、果酒等保健飲品、功能食品、營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品和藥品等系列產(chǎn)品[4-5]。

藍(lán)靛果果實(shí)中富含大量的花青素，花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而形成糖苷，稱為花色苷(anthocyanin)?，F(xiàn)代研究表明，花色苷具有消除自由基、抗衰老、抗異變、抗炎癥[6-7]、改善視力、預(yù)防和治療心血管疾病[8]、抗癌[9]、提高免疫力等多種生理活性功能，花色苷發(fā)揮這些生理活性大多因?yàn)槠淇梢耘c很多氧化劑發(fā)生反應(yīng)，減少氧化劑對(duì)人機(jī)體的危害[10]。近年來，對(duì)花色苷的研究主要集中于對(duì)各類植物及其產(chǎn)品中的花色素苷的種類數(shù)量的定性、定量研究和對(duì)花色素苷藥理學(xué)的研究?jī)蓚€(gè)方

面[11]。對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取條件的研究已有較多的報(bào)道，但提取條件對(duì)藍(lán)靛果花色苷抗氧化活性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以速凍藍(lán)靛果為原料，采用溶劑法，考察不同提取條件對(duì)花色苷提取量及花色苷抗氧化活性的影響，確定最佳提取條件，旨在為天然抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑市售藍(lán)靛果，清洗瀝干后包裝置于冰箱凍藏備用。DPPH Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；756PC紫外-可見光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)靛果花色苷的提取工藝流程

藍(lán)靛果→除雜→沖洗、瀝干→凍藏→凍樣研磨→加浸提液提取→抽濾→濾液

1.3.2 藍(lán)靛果花色苷的提取

精確稱取10g藍(lán)靛果凍果，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后置于錐形瓶中，加入一定體積的提取液并密封，放入恒溫水浴鍋中。以花色苷提取量和抗氧化能力為考核指標(biāo)，分別研究不同提取溶劑、提取劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取pH值、提取次數(shù)等因素對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影響，在此基礎(chǔ)上選取料液比、提取劑體積分?jǐn)?shù)、溫度和時(shí)間為影響因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。

1.3.3 花色苷含量的測(cè)定方法

濾液用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液定容后，以緩沖液作空白對(duì)照，進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為520nm。在此波長(zhǎng)處進(jìn)行提取液吸光度測(cè)定，通過色價(jià)法計(jì)算，正交試驗(yàn)中將提取液定容至500mL，用吸光度表示花色苷的含量[12]，根據(jù)吸光度大小確定優(yōu)化工藝條件。

1.3.4 羥自由基清除率的測(cè)定[13]

在試管中分別加入1mL 10mmol/L水楊酸乙醇溶液、樣液、1mL 10mmol/L FeSO4溶液、最后加入2mL 10mmol/L H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510nm處測(cè)定吸光度AX；用蒸餾水代替樣液，測(cè)得的吸光度值為A0；取2mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)得的吸光度為AX0。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。羥自由基清除率I表示為：

1.3.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定[14]

精確移取樣液與3mL 60μmol/L的DPPH溶液均勻混合，反應(yīng)30min后在517nm處測(cè)定其吸光度Ai，同時(shí)用相同的方法測(cè)定等體積無水乙醇與3mL 60 μ mol/L的DPPH溶液混合后的吸光度A0，以及樣品溶液與3mL無水乙醇混合液的吸光度Aj。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。通過下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率R：

1.3.6 確定最佳工藝條件的正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳提取條件。以料液比、提取劑體積分?jǐn)?shù)、溫度和時(shí)間為影響因素，分別以花色苷含量、羥自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用正交表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法進(jìn)行分析[15]，各因素和水平的選取結(jié)果如表1所示。

表1 工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

按料液比1:10加入提取溶劑，提取溫度50℃、提取時(shí)間90min。提取溶劑分別為無水乙醇、70%乙醇溶液、水、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醚，考察提取溶劑對(duì)提取物中花色苷含量及其抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of solvents on anthocyanins extraction

由圖1可知，花色苷的吸光度值差異顯著，藍(lán)靛果花色苷溶于水和乙醇等極性溶劑，70%乙醇溶液提取效果最好，其次為水，接下來是無水乙醇和正丁醇，乙醚和乙酸乙酯提取效果較差。

2.2 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影響

在料液比1:10、提取溫度50℃、提取時(shí)間90min、

pH2的條件下，考察不同乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量及其抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量和抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on anthocyanins extraction and hydroxyl and DPPH radical scavenging capacities of anthocyanins from the fruits of Lonicera edulis

由圖2可知，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，花色苷提取量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，花色苷提取量增至最大，吸光度可達(dá)0.800，然后隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步升高，花色苷提取量反而減少。乙醇的加入使提取液的極性降低，說明花色苷的提取與提取液的極性有關(guān)。隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，藍(lán)靛果花色苷對(duì)·OH和DPPH自由基的清除能力越來越強(qiáng)，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，花色苷清除能力最強(qiáng)，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別比乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)清除率提高了20.21%和7.14%。因此初步選擇70%乙醇溶液作為提取溶劑。

2.3 提取溫度對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影響

按照料液比1:10加入70%乙醇溶液提取，提取pH2、提取時(shí)間90min，研究不同提取溫度對(duì)花色苷提取量及其抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同提取溫度對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量和抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanins extraction and hydroxyl and DPPH scavenging capacity of anthocyanins from the fruits of Lonicera edulis

由圖3可知，隨著溫度的升高，花色苷提取量呈增加趨勢(shì)，但是溫度增至50～60℃之后，花色苷提取量呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎诨ㄉ帐且环N活性物質(zhì)，溫度過高，會(huì)影響花色苷的穩(wěn)定性，導(dǎo)致花色苷部分分解，從而造成了吸光度下降。30℃時(shí)提取物對(duì)·OH清除率遠(yuǎn)小于80℃時(shí)提取物，但對(duì)DPPH自由基的清除率卻略高于80℃時(shí)提取物?？赡苡捎跍囟炔煌?，使花色苷芳香環(huán)上的化學(xué)基團(tuán)的位置和種類發(fā)生改變，從自由基分子接受未配對(duì)電子的能力也隨之發(fā)生變化，再加上兩種自由基反應(yīng)機(jī)制不同造成的。提取溫度為50℃時(shí)，藍(lán)靛果提取物的·OH清除率最高，但是對(duì)DPPH自由基清除率與60℃時(shí)清除率相差無幾，因此初步選擇提取溫度為50℃。

2.4 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影響

按照料液比1:10加入70%乙醇溶液提取，提取pH2、提取溫度50℃，研究不同提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量及其抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量和抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanins extraction and hydroxyl and DPPH scavenging capacity of anthocyanins from the fruits of Lonicera edulis

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷溶出增加，但是色素不穩(wěn)定，時(shí)間過長(zhǎng)，花色苷會(huì)因發(fā)生氧化反應(yīng)而有所分解，導(dǎo)致吸光度下降。隨著提取時(shí)間的增加，清除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為90min時(shí)，提取物對(duì)·OH和DPPH自由基的清除率都高于其他提取溫度條件。當(dāng)提取時(shí)間為120min時(shí)，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別比90min時(shí)下降了2.10%和11.63%，因此初步選擇提取時(shí)間為90min。

2.5 pH值對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影響

按料液比1:10加入70%乙醇溶液、提取溫度50℃、浸提90min，研究不同pH值對(duì)花色苷提取量及其抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取pH值對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量和抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of pH on anthocyanins extraction and hydroxyl and DPPH scavenging capacity of anthocyanins from the fruits of Lonicera edulis

由圖5可知，pH1時(shí)花色苷吸光度最高，隨著pH值增加，溶液的吸光度呈顯著降低趨勢(shì)。花青素在酸性溶液中，以藍(lán)色的醌式(脫水)堿(A)、紅色的黃烊陽正離子(AH+)、無色的甲醇假堿(B)和查爾酮(C)4種形式存在，其中AH+和A為有色物質(zhì)，存在著如下平衡：A AH+B C，pH值的增加導(dǎo)致這兩種有色物質(zhì)濃度減少，故吸光度降低。過高或過低的pH值都會(huì)影響花色苷的穩(wěn)定性。因此，提取pH2時(shí)最佳。pH1時(shí)，對(duì)·OH清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他，而pH2時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率最高。此變化規(guī)律與藍(lán)靛果提取物吸光度的變化規(guī)律不一致。pH值對(duì)花色苷的結(jié)構(gòu)有影響，導(dǎo)致其對(duì)·OH和DPPH自由基清除率規(guī)律變化不一致，原因可能是兩種反應(yīng)機(jī)理不同，不同的花色苷形式的電子數(shù)不一致造成的。因此初步選擇提取pH2。

2.6 液料比對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

按不同液料比加入pH2、70%乙醇溶液、水浴50℃、浸提90min，抽濾，定容，測(cè)吸光度，研究不同料液比對(duì)花色苷提取量的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 料液比對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.6 Effect of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction and hydroxyl and DPPH scavenging capacity of anthocyanins from the fruits of Lonicera edulis

由圖6可知，隨著液體用量的增大，花色苷溶出越多，但是若采取較大的液料比，會(huì)使提取成本增加，而且還會(huì)增加接下來的濃縮工作量，因此實(shí)驗(yàn)中采用液料比為10:1。

2.7 提取次數(shù)對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

按料液比1:10加入70%乙醇溶液提取，提取pH2、提取溫度50℃、浸提90min，累計(jì)提取5次，研究提取次數(shù)對(duì)花色苷提取量的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 提取次數(shù)對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響Fig.7 Effect of extraction tnumber on anthocyanins extraction and

由圖7可知，提取次數(shù)越多，累計(jì)提取量越高，但是提高幅度不同，第3次提取之后花色苷提取量增加率已經(jīng)非常低了，因此提取3次即可。

2.8 正交試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)結(jié)果采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法，選用Z分綜合評(píng)價(jià)法(Z-score)進(jìn)行指標(biāo)的無量綱化。其中花色苷含量、·OH清除率和DPPH自由基清除率這三個(gè)指標(biāo)均為“高優(yōu)”指標(biāo)，結(jié)果見表2、3。

表2 工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

由表3極差分析結(jié)果可知，各因素影響程度的大小關(guān)系為B＞A＞C＞D，即提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響最大，料液比次之，溫度的影響較小，時(shí)間的影響最小。試驗(yàn)得到的藍(lán)靛果花色苷提取的最優(yōu)組合為A3B2C3D2，即料液比1:15、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度60℃、提取時(shí)間90min。在此條件下，藍(lán)靛果花色苷含量可達(dá)0.789，·OH清除率為18.92%，DPPH自由基清除率為41.57%。

表3 Z分綜合評(píng)價(jià)法分析結(jié)果Table3 Results of Z-score comprehensive evaluation of orthogonal array experimental result

3 結(jié) 論

由于天然抗氧化劑發(fā)揮抗氧化活性往往是通過多種途徑，所以本實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法，以對(duì)·OH和DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，得到提取具有較高抗氧化活性藍(lán)靛果花色苷的提取條件。本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了溶劑浸提法提取藍(lán)靛果花色苷的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1:15、提取溫度60℃、提取90min、提取pH2、提取次數(shù)3次。各因素影響程度的大小關(guān)系為提取劑體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞溫度＞時(shí)間。藍(lán)靛果是一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的漿果，可以有效地防止羥自由基等氧化劑對(duì)人體造成傷害，從而提高免疫力、防治疾病，可以作為一種天然抗氧化劑的重要來源。

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Effect of Extraction Conditions on Antioxidant Properties of Anthocyanins from the Fruits of Lonicera edulis

BAO Yi-hong，LI Wen-xing，QI Jun-jun，WANG Zhen-yu*
(Sohool of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Anthocyanins in the fruits of Lonicera edulis was extracted using aqueous ethanol, and the effects of six extraction conditions on anthocyanin extraction and the abilities of the extracted anthocyanins to scavenge hydroxyl and DPPH free radicals were evaluated by single factor and orthogonal array design methods. Using the Z-score comprehensive evaluation method, the orthogonal array experimental results were analyzed. UV spectrophotometry and a H2O2/Fe system were used to determine anthocyanin extraction yield and hydroxyl free radical scavenging rate, respectively. Ethanol concentration of 70%, material/liquid ratio of 1:15, extraction temperature of 60 ℃, extraction duration of 90 min, pH of 2 and extraction number of 3 were found optimal. The absorbance at 520 nm of the extract obtained under the optimal extraction conditions was 0.789, and tis hydroxyl free radical and DPPH radical scavenging rates were 18.92%and 41.57% respectively.

Lonicera edulis；anthocyanin；extraction；antioxidant properties

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0020-05

2010-06-07

哈爾濱市科技局重大攻關(guān)項(xiàng)目(2008AA6A)

包怡紅(1970—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分生物轉(zhuǎn)化和食品生物技術(shù)。E-mail：baoyihong@163.com

*通信作者：王振宇(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘钚晕镔|(zhì)及功能食品。E-mail：wzy219001@yahoo.com.cn