都立輝，霍貴成*，鞠興榮，劉 芳

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150030；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

一株植物乳桿菌的分離鑒定及其隱蔽質(zhì)粒的序列分析

都立輝1，霍貴成2,*，鞠興榮1，劉 芳3

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150030；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離到1株乳酸桿菌，經(jīng)API 50 CH細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列分析后鑒定為植物乳桿菌。分析該菌的質(zhì)粒圖譜后發(fā)現(xiàn)該菌攜帶多個(gè)質(zhì)粒，將其中的小質(zhì)粒pLD1測(cè)序，結(jié)果顯示該質(zhì)粒的大小為2112bp，堿基G+C含量為37.8%，只編碼1個(gè)復(fù)制蛋白，其中有1個(gè)17bp的序列重復(fù)了13次。BLAST發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒同pLP2000等的同源性在95%以上，其中復(fù)制蛋白同其他質(zhì)粒存在一些氨基酸差異。pLD1質(zhì)粒序列的GenBank登陸號(hào)為NC_012220，并且它可用于構(gòu)建良好的乳桿菌基因工程載體。

植物乳桿菌；隱蔽質(zhì)粒；序列分析；復(fù)制蛋白

乳酸菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，具有許多的益生功能，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[1-2]，并且某些乳酸菌還被用來外源表達(dá)一些功能物質(zhì)。但是由于乳酸菌表達(dá)載體很少，尤其是具有特殊用途的表達(dá)載體更少，限制了乳酸菌生物工程的發(fā)展[3]。某些乳酸菌，如乳球菌、腸球菌、鏈球菌等都攜帶一些質(zhì)粒[4]。這些質(zhì)?？赡芫幋a一些重要的特性，例如噬菌體抗性、抗生素抗性、乳糖利用能力等。植物乳桿菌也可能攜帶一些質(zhì)粒，但是由于對(duì)其研究較少，目前認(rèn)為其中多數(shù)質(zhì)粒還是隱蔽型質(zhì)粒[5-6]，僅有很少一部分質(zhì)粒已被測(cè)序，例如1個(gè)10877bp的pMD5057編碼有噬菌體抗性，1個(gè)2025bp的pLKS質(zhì)粒編碼了四環(huán)素抗性等[7-8]。通過對(duì)菌株攜帶的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定和功能分析，不僅能夠發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒編碼的重要特性，也能為乳酸菌遺傳工程的發(fā)展提供重要的工具。

近幾年來，有關(guān)乳酸菌遺傳工具的研究越來越多，其目標(biāo)是從基因水平上提高乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能。相對(duì)于乳酸乳球菌表達(dá)載體，乳桿菌的表達(dá)載體較少[9]。

由于分離自食品中的乳酸菌及其質(zhì)粒是食品級(jí)的，不存在食品安全問題。因此，本研究擬對(duì)由傳統(tǒng)乳制品中分離到的1株植物乳桿菌KLDS1.0801中的小質(zhì)粒pLD1進(jìn)行全序列測(cè)定及功能分析，為構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸乳桿菌專用基因工程載體提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌(E. coli DH5α)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei ATCC 7469)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

E. coli DH5α用LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)；乳桿菌用MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)，氨芐青霉素在大腸桿菌中使用的質(zhì)量濃度為100μg/mL。

1.2 質(zhì)粒、試劑與儀器

克隆載體pMD18-T、限制性核酸內(nèi)切酶 寶生物工程(大連)有限公司；API 50 CH試劑條、API 50 CHL培養(yǎng)基 法國(guó)生物梅里埃公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒 天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒 上海華舜生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

9700 PCR System 美國(guó)ABI公司；UVP凝膠成像系統(tǒng) UVP公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；搖床振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司。

1.3 乳酸菌的分離、純化和鑒定

將傳統(tǒng)乳制品在脫脂乳培養(yǎng)基中活化兩代，然后取1mL樣品，用滅菌生理鹽水經(jīng)適當(dāng)梯度稀釋后涂布于含有3g/100mL CaCO3的MRS平板上，37℃培養(yǎng)24h，挑選出周圍形成透明圈的菌落，革蘭氏染色后鏡檢，將G+菌株繼續(xù)劃線于MRS平板，直至確定為純菌后保存。

參照文獻(xiàn)[10]，凡是革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性的菌株初步確定為乳酸菌。在初步鑒定的基礎(chǔ)上，使用API 50 CH試劑條和API 50 CHL培養(yǎng)基對(duì)純化的乳酸菌進(jìn)行鑒定，嚴(yán)格按照試劑條和培養(yǎng)基的使用說明書進(jìn)行操作，使用L. casei ATCC7469和L. acidophilus ATCC 4356作為質(zhì)控菌株。

1.4 16S rRNA基因序列的擴(kuò)增和測(cè)序

乳酸菌基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增引物分別是上游引物(5′-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物(5′-CTACGGCTACCTFGTFACGA-3′)[12]，引物合成和DNA序列測(cè)定由上海生物工程有限公司完成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入克隆載體pMD18-T后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆測(cè)序。

1.5 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用BLAST，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。然后從GenBank中提取乳酸桿菌屬內(nèi)代表菌株的16S rRNA基因序列，與測(cè)定的序列共同用ClustalX1.83校準(zhǔn)排齊進(jìn)行多序列比較后，用MEGA 4軟件以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[13]。

1.6 質(zhì)粒的提取及其序列測(cè)定

植物乳桿菌KLDS 1.0801內(nèi)源質(zhì)粒的提取采用天根公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行，經(jīng)過以下修改：將菌體離心后重懸于含有30mg/mL溶菌酶的STE緩沖液(50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，1mmol/L的EDTA，質(zhì)量濃度為6.7g/100mL的蔗糖，pH8.0)中，37℃溫育20min，其余操作按照說明書進(jìn)行。

回收其中的小質(zhì)粒，選擇不同的酶，單酶酶切該質(zhì)粒，分析其含有的酶切位點(diǎn)。以該質(zhì)粒上只有1個(gè)酶切位點(diǎn)的酶酶切該質(zhì)粒，回收酶切后的線性片段。借助于Taq酶的特性及PCR擴(kuò)增原理補(bǔ)平酶切后的黏性末端并在3′末端引入堿基A，反應(yīng)體系(總體積50μL)：40μL回收后的酶切片段，4μL dNTP，5μL 10×PCR Buffer，1μL Taq酶。將反應(yīng)體系置于72℃保溫20min后回收DNA片段，同pMD18-T載體連接后熱轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆測(cè)序。借助于克隆載體的測(cè)序引物測(cè)定出部分序列，然后根據(jù)已測(cè)序列設(shè)計(jì)引物對(duì)插入的整個(gè)片段測(cè)序[14]。拼接各個(gè)測(cè)定序列獲得該質(zhì)粒的全序列信息。

1.7 質(zhì)粒的分析

利用NCBI等國(guó)際核苷酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)以及DNAMAN等生物學(xué)軟件對(duì)質(zhì)粒的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行分析，并將該質(zhì)粒全序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸乳桿菌的分離

從樣品中分離到1株乳酸桿菌，在MRS平板上培養(yǎng)24h后，菌落呈乳白色半透明，邊緣整齊；革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌呈革蘭氏陽性，細(xì)長(zhǎng)桿狀，單生，將其命名為KLDS 1.0801。

2.2 ATB的鑒定結(jié)果

目測(cè)API試劑條的檢測(cè)結(jié)果，然后將檢測(cè)結(jié)果輸入電腦，使用ATB軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果表明KLDS 1.0801為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其中鑒定百分率(id%)為99.9%，模式頻率(T)為0.78。

2.3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增得到的KLDS 1.0801菌株的16S rRNA基因序列為1529bp，該基因序列的GenBank注冊(cè)號(hào)為

FJ755813。將KLDS 1.0801的16S rRNA基因序列同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的乳桿菌屬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行多序列比較后繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列建立的乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Lactobacilli based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，KLDS 1.0801同L. plantarum JCM 1149的親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。

2.4 質(zhì)粒pLD1的提取和全序列測(cè)定

圖2 植物乳桿菌KLDS 1.0801內(nèi)源性質(zhì)粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of L. plantarum KLDS 1.0801

由圖2可知，該菌株攜帶多個(gè)質(zhì)粒，將其中的小質(zhì)粒命名為pLD1?；厥召|(zhì)粒pLD1，進(jìn)行單酶酶切分析后發(fā)現(xiàn)SpeⅠ酶能夠酶切該質(zhì)粒，并且只有1個(gè)酶切位點(diǎn)，結(jié)果見圖3。選取SpeⅠ酶切質(zhì)粒pLD1，回收線性片段，末端補(bǔ)平后連入克隆載體。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒大小為2112bp。質(zhì)粒pLD1序列的GenBank注冊(cè)號(hào)為NC_012220。

圖3 質(zhì)粒pLD1酶切分析Fig.3 Restriction enzyme analysis of pLD1

2.5 質(zhì)粒的功能分析

質(zhì)粒pLD1的G+C含量為37.8%。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：該質(zhì)粒與質(zhì)粒pLP2000(AY096004)和pLP1(M31223)等的同源性很高，相似度都在95%以上。通過ORF搜索，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒僅有1個(gè)編碼框，以SpeⅠ酶切位點(diǎn)為編號(hào)1，該編碼框的位置位于276到1232，共957bp，編碼1個(gè)318個(gè)氨基酸殘基的復(fù)制蛋白。如圖4所示，質(zhì)粒pLD1同質(zhì)粒pLP2000的復(fù)制蛋白在氨基酸水平上的同源性很高，只存在幾個(gè)氨基酸殘基的差異。該復(fù)制蛋白編碼了pfam01446保守結(jié)構(gòu)域，屬于復(fù)制蛋白第一超家族，是滾環(huán)復(fù)制蛋白，因此質(zhì)粒pLD1應(yīng)該是滾環(huán)復(fù)制類型的。這一復(fù)制蛋白超家族廣泛分布在乳桿菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌以及芽孢桿菌等眾多細(xì)菌種類中。通過重復(fù)序列檢索發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒有13個(gè)重復(fù)序列，在1351到1587之間，有1個(gè)17bp的序列“CATTATCATGTAGTGCG”正向重復(fù)了13次，該重復(fù)序列可能和質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)。該質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)在2084到2097之間，主要的酶切位點(diǎn)見圖5。

圖4 質(zhì)粒pLD1和pLP2000的復(fù)制蛋白的氨基酸序列比較Fig.4 Alignment of amino acid sequences in replication proteins from pLD1 and pLP2000

圖5 質(zhì)粒pLD1的酶切圖譜Fig.5 Restriction enzyme map of plasmid pLD1

3 討 論

乳酸桿菌是重要的工業(yè)微生物，該菌屬中大多數(shù)菌含有的質(zhì)粒一般較少，迄今為止報(bào)道的只有17種(www. ncbi.nlm.nih.gov/genomes)，相對(duì)于研究比較成熟的含質(zhì)粒種類較多的乳酸乳球菌，后者已經(jīng)出現(xiàn)了國(guó)際上廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)型NICE表達(dá)系統(tǒng)[15]，乳酸桿菌可用的基因工程操作工具(如克隆載體、表達(dá)載體等)嚴(yán)重匱乏。這一狀況顯著制約了乳酸桿菌基因改造的實(shí)施。

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室中保藏的乳酸桿菌進(jìn)行篩查，在多個(gè)不同生境中分離得到的乳酸桿菌中都發(fā)現(xiàn)了相似大小的質(zhì)粒，暗示該質(zhì)?？赡艽嬖谟诓煌樗釛U菌中，這一發(fā)現(xiàn)表明該質(zhì)粒的宿主范圍比較寬且可能在宿主中能較穩(wěn)定的存在。通過連續(xù)傳代50次后，提取質(zhì)粒鑒定，質(zhì)粒圖譜沒有變化，證實(shí)這一質(zhì)粒能在乳酸桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。

質(zhì)粒序列的唯一性決定了質(zhì)粒是一種不可多得的資源。20年來乳酸菌基因工程技術(shù)取得了重大進(jìn)展，圍繞著乳酸菌和乳酸菌發(fā)酵食品的生物技術(shù)研究是當(dāng)前歐洲和美國(guó)生物技術(shù)領(lǐng)域的重大研究課題。人們希望利用基因工程技術(shù)來極大地改良發(fā)酵劑的各種性能。因此，發(fā)現(xiàn)和利用具有特定功能的新質(zhì)粒，對(duì)于乳酸菌的遺傳研究和構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程載體就顯得尤其重要[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中獲得的質(zhì)粒來自于食品級(jí)的乳酸菌，且能在不同宿主中廣泛存在，質(zhì)粒本身比較小，這些特性使得利用其構(gòu)建適宜的基因工程載體成為可能。勿庸置疑，無論從食品加工的角度還是更有利于人類健康的方面來看，這些工具的存在都為發(fā)酵劑菌株遺傳性狀的改善提供了新的可能性。

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Isolation and Identification of a Lactobacillus plantarum Strain and Sequence Analysis of Its Cryptic Plasmid

DU Li-hui1，HUO Gui-cheng2,*，JU Xing-rong1，LIU Fang3
(1. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；3. Institute of
Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A strain isolated from traditionally fermented dairy product was identified as Lactobacillus plantarum based on API 50 CH bacteria identification system and 16S rRNA sequence analysis. Plasmid profile indicated that this strain harbored several plasmids. A small plasmid designated as pLD1 was subjected to sequence analysis. This small plasmid had 2112 bp and G+C content of 37.8%. Meanwhile, a sequence with 17 bp was repeated 13 times in this small plasmid. BLAST results showed that pLD1 plasmid had more than 95% similarity with pLP2000 and that there was a difference in replication protein among this plasmid and others. The accession number of this small plasmid is NC_012220 and it is useful for the construction of genetically engineered vectors.

Lactobacillus plantarum；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0236-04

2010-01-04

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z344)；南京財(cái)經(jīng)大學(xué)科研基金項(xiàng)目(C0837)

都立輝(1981—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dlhlh2000@yahoo.com.cn

*通信作者：霍貴成(1958—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぁ-mail：gchuo58@126.com